纳米抗体液相阻断 ELISA：评估塞内卡病毒 A 疫苗效力的创新之选

为解决传统塞内卡病毒 A（SVA）疫苗效力评估方法耗时耗力且不符动物福利要求的问题，研究人员开发基于纳米抗体的液相阻断 ELISA（nbLPB-ELISA）。结果显示该方法与病毒中和试验（VNT）高度相关，能评估疫苗保护力，为 SVA 疫苗评估提供新途径。

　　在猪的养殖世界里，有一种名为塞内卡病毒 A（Senecavirus A，SVA）的病毒，它就像一个隐藏的 “破坏者”。SVA 属于小 RNA 病毒科（Picornaviridae）塞内卡病毒属，其基因组能编码多种蛋白。自 2007 年被发现会引发猪的水泡病，导致新生仔猪流产和死亡率上升以来，它在全球多个国家的猪场 “肆虐”，像中国、美国、巴西等都深受其害。而且，它引发的症状和口蹄疫病毒（FMDV）引起的很相似，这给诊断和防控带来了极大的困难。

目前，应对 SVA 感染的主要手段是接种疫苗。然而，评估 SVA 疫苗效力的传统方法却存在诸多问题。一方面，检测中和抗体（NAb）依赖活病毒和细胞病变效应测定，不仅耗费大量时间和人力，结果还容易受到主观因素影响。另一方面，病毒攻毒实验虽然能直接评估疫苗保护效果，但使用活病原体违背了动物福利原则。所以，寻找一种简单、快速、可靠且符合动物福利的方法来评估 SVA 疫苗效力，成为了科研人员亟待解决的难题。

为了攻克这一难题，中国农业科学院兰州兽医研究所的研究人员勇挑重担，展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology 》上，为 SVA 疫苗效力评估领域带来了新的曙光。

研究人员开展的主要技术方法包括：首先是细胞培养技术，培养了猪肾（IBRS-2）细胞和人胚胎肾（HEK293 F）细胞，为后续实验提供细胞模型；其次是蛋白质纯化与表达技术，从感染 SVA 的羊驼中获取 VHH 基因片段，克隆到表达载体并在 293 F 细胞中表达，纯化出 V1-VHH；还有免疫分析技术，利用 ELISA、病毒中和试验（VNT）、免疫荧光测定（IFA）等方法检测抗体反应性和中和活性，通过棋盘滴定法优化 nbLPB-ELISA 条件；最后，收集大量不同状态猪的血清样本，如临床健康但 SVA 抗体阴性猪、实验感染或接种疫苗猪的血清，用于各项检测分析。

下面来看具体的研究结果：

• VHH 的制备与鉴定：通过噬菌体筛选技术获得了能与 SVA 特异性反应的 V1-VHH。将编码 V1-VHH 基因的载体转染 293 F 细胞，利用蛋白 A 亲和层析纯化 VHH。经检测，V1-VHH 分子量约为 42kDa，产量可观，且能特异性地与感染 SVA 的 IBRS-2 细胞反应，在细胞模型中还能有效阻止 SVA 附着细胞表面，半数中和滴度为 0.045μg/mL，也能以剂量依赖方式置换已结合在细胞表面的病毒粒子，半数中和滴度为 0.28μg/mL。
• nbLPB-ELISA 的条件优化：采用间接 ELISA 评估 V1-VHH 对 SVA 的亲和力，发现其半数抑制浓度为 0.26nM。棋盘滴定法确定了捕获抗体（0.25μg/mL）、检测抗体（0.125μg/mL）的最佳浓度，5% 脱脂牛奶作为封闭液封闭 60min 效果最佳。同时，优化了血清、生物素化 V1-VHH、HRP - 链霉亲和素孵育时间以及 TMB 显色时间，确定了 nbLPB-ELISA 的最佳反应条件。
• nbLPB-ELISA 的性能评估：利用 87 份 SVA 阴性血清和 105 份 SVA 感染或疫苗免疫猪的血清确定 nbLPB-ELISA 的临界值、特异性和敏感性。结果显示，临界值设定为 1.65log₁₀时，受试者工作特征曲线下面积（AUC）达到 0.9996，敏感性和特异性分别为 100% 和 99.04%。用感染猪的 PCV2、CFSV、PRRSV 和 FMDV 阳性血清评估交叉反应性，发现 nbLPB-ELISA 与这些病毒血清无交叉反应。通过检测 5 份 SVA 阳性和 5 份 SVA 阴性血清样本评估重复性，批内和批间变异系数均在 0.00 - 0.09%，表明重复性良好。
• nbLPB-ELISA 与其他检测方法的比较：对比 nbLPB-ELISA 与 VNT 检测 68 份猪血清样本中 SVA 的结果，二者阳性符合率达 100%，皮尔逊相关系数为 0.83，一致性良好。同时评估 nbLPB-ELISA、cELISA 和 BIOSTONE AsurDx? SVA Ab 测试试剂盒的性能，发现 nbLPB-ELISA 与 cELISA、BIOSTONE AsurDx? SVA Ab 测试试剂盒的符合率分别为 97.44%（76/78）和 98.72%（77/78），显示出 nbLPB-ELISA 较高的敏感性。
• 确定疫苗保护阈值：研究人员用 nbLPB-ELISA 检测 55 份接种 SVA 病毒样颗粒（VLP）或灭活疫苗猪的血清样本以及 60 份 SVA 阴性猪的血清样本，发现当 NAb 滴度≥2.41log₁₀（相当于 256）时，能提供 100% 的保护；滴度为 1.81log₁₀（相当于 64）和 2.11log₁₀（相当于 128）时，保护率分别为 57.1% 和 70% 。

研究结论与讨论部分指出，nbLPB-ELISA 与 VNT 有效性相似，能反映接种动物的 NAb 滴度，且比之前的检测方法更能体现真实血清 NAb 滴度。与其他检测试剂盒相比，nbLPB-ELISA 敏感性更高。虽然在低抗体水平和保护率之间存在 “灰色地带”，但总体而言，nbLPB-ELISA 为加速 SVA 疫苗开发、减少动物使用以及评估猪群 SVA 疫苗效力提供了一种实用且有效的新方法，在 SVA 疫苗的生产和应用中，对监测保护性抗体具有重要意义，为防控 SVA 感染、保障养猪业健康发展提供了有力的技术支持。