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在细胞报告基因系统中，现有检测手段存在信号不稳定、成本高等问题。研究人员开展了以构建新型报告基因系统为主题的研究，成功开发出 sHRP 系统。该系统信号稳定、成本低、灵敏度高，为药物筛选和细胞信号研究提供了新工具。
在生命科学研究领域，细胞报告基因系统对于探究基因表达调控机制至关重要。然而，传统的报告基因系统，如萤火虫荧光素酶（FLuc），虽然检测动态范围广，但需要裂解细胞，这不仅增加了操作时间，还阻碍了对活细胞的实时监测。后来开发的分泌型 FLuc，细胞外表达效果不佳，且其催化需要 ATP 和 Mg2?，在细胞外环境中这些物质显著减少，影响了其功能。其他荧光素酶，像海肾荧光素酶（RLuc），虽然不依赖 ATP 和 Mg2?，可以在细胞外发挥功能，但其稳定性差，活性在短时间内就会大幅下降。相对较新的 Cypridina 和 Gaussia 荧光素酶（CLuc 和 GLuc）是天然分泌酶，能产生较强的生物发光，检测灵敏度高，但 CLuc 的底物 vargulin 成本高昂，且它们的稳定性研究相对较少。鉴于这些问题，来自高雄医学大学的研究人员开展了一项旨在开发更稳定、低成本且灵敏度相当的报告基因系统的研究。最终，他们成功构建了分泌型辣根过氧化物酶（sHRP）报告基因系统，这一成果对于推动药物筛选和细胞内信号管理研究具有重要意义，相关论文发表在《Journal of Biological Engineering》。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下关键技术方法：一是质粒构建技术，通过 PCR 等手段构建多种含有不同转录因子的质粒，如 pTEAD1-sHRP-myc、pAP-1-sHRP-myc 等；二是蛋白表达与检测技术，利用转染技术将构建好的质粒转入 HEK-293 T 细胞，通过收集细胞和上清液，运用 Western blotting 和 ELISA 等方法检测蛋白表达和活性；三是信号检测与分析技术，使用不同底物（ABTS、TMB、vargulin 等）与酶反应，通过酶标仪检测吸光度或发光信号，分析信号灵敏度、稳定性等指标。
下面来详细看看研究结果：
- 工程化 sHRP 的功能探究：研究人员将 HRP 进行基因工程改造，使其能够分泌到细胞上清液中，并添加 c -myc 标签以便检测。通过 Western blotting 分析发现，sHRP 和 CLuc 的分子量比预测值大，这可能是由于翻译后糖基化修饰导致的，且糖基化可能有助于 sHRP 的催化能力。对 sHRP 和 CLuc 进行功能分析，用不同底物反应并对上清液进行系列稀释检测，结果表明 sHRP 和 CLuc 均能正常表达且功能完整，sHRP 总体比 CLuc 更敏感。
- sHRP 报告基因系统分泌的重要性：构建胞质型 HRP（cHRP），与 sHRP 对比。Western blotting 和 ELISA 检测发现，只有 sHRP 的上清液有阳性染色，且 sHRP 上清液的信号强度和颜色分辨率更好，说明 sHRP 可通过上清液间接反映启动子活性，无需裂解细胞就能监测启动子活性。
- sHRP 与 CLuc 报告系统在癌症信号通路中的灵敏度和信号动力学比较：选择与癌症信号相关的转录因子 TEAD1 和 AP-1，构建含有 sHRP 和 CLuc 的多种质粒。通过对质粒和上清液的系列稀释检测发现，sHRP 与 TMB 反应产生的显色信号与 CLuc - vargulin 相当，甚至更敏感，且在不同设计中，sHRP - TMB 和 CLuc - vargulin 在不同条件下具有最佳检测动态范围（D.R.） ，证明选择合适底物时，sHRP 能产生与 CLuc - vargulin 可比的信号灵敏度和 D.R.。
- sHRP 和 CLuc 报告基因系统的信号和酶稳定性比较：对 sHRP 和 CLuc 系统的底物进行稳定性分析，检测不同时间点的信号强度。结果显示，无论是否有血清存在，sHRP 组的信号稳定性都优于 CLuc 组，sHRP - ABTS 和 sHRP - TMB 的信号半衰期远长于 CLuc - vargulin。在酶稳定性方面，不同底物和条件下各有差异，但总体上 sHRP 和底物的稳定性明显优于 CLuc - vargulin。
- sHRP 在报告基因应用中的潜力评估：以 NF-κB 为转录因子，用肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）诱导，检测 sHRP 的报告基因功能。结果显示，293 T - NF-κB - sHRP 细胞上清液的显色信号与 TNF-α 浓度呈正相关，TMB 组的反应信号更好。收集不同时间点的上清液检测发现，NF-κB - RE 启动子的激活可持续约 12 h，表明 sHRP 能实时、准确地反映启动子活性，适合作为新型报告基因系统。
- 评估培养基环境因素对定量测量的影响：分析细胞培养上清液成分和培养基对 sHRP - ABTS/TMB 显色信号的影响。结果表明，内源性酶和培养基成分对 sHRP 的检测干扰小，不同培养基对催化和未催化底物的吸光度影响不显著，证明 sHRP 具有低干扰、高特异性和高灵敏度的特点，适用范围广。
研究结论和讨论部分指出，sHRP 与 ABTS 和 TMB 底物结合使用时，是一种非常稳定的酶，能够产生灵敏、快速的显色反应和稳定的信号，可适应不同的培养基环境，且底物成本低廉，适合作为荧光素酶的替代物用于新型报告基因系统。与其他分泌型报告基因（如分泌型胚胎碱性磷酸酶 SEAP、GLuc 等）相比，sHRP 在信号稳定性和成本方面具有优势。不过，该研究也存在一定局限性，如 CLuc 信号在未稀释点不稳定，sHRP 尚未在体内研究中进行探索。但总体而言，sHRP 为药物筛选和细胞信号分析提供了更可靠、经济的工具，具有广阔的应用前景，有望推动相关领域的进一步发展。
