编辑推荐：
乳酸菌在食品工业和益生菌领域意义重大，但传统转基因方法受限。研究人员引入 Target-AID 系统开展乳酸菌基因编辑研究。结果显示该系统能精准突变、减少咪唑丙酸（ImP）生成等。这加速了乳酸菌应用与基础研究，为开发新型益生菌提供了有力工具。
在微生物的奇妙世界里，乳酸菌可是一群 “明星选手”。它们广泛活跃于食品工业，酸奶、奶酪这些美味的发酵食品都离不开它们的 “辛勤劳作”。不仅如此，乳酸菌作为益生菌，对人体健康有着诸多益处，比如调节肠道微生物群落、增强免疫功能，甚至还能缓解压力带来的心理问题。然而，尽管乳酸菌好处多多，人们对其发挥这些健康功效的遗传和分子机制却知之甚少。想要让乳酸菌在益生菌和治疗领域发挥更大的作用，就需要深入了解它们，开发出更有效的工程改造工具。但传统的转基因方法，在实际用于益生菌或食品时，很难被大众接受，这就像给研究人员出了一道难题。
为了解开这道难题，来自日本神户大学（Kobe University）等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们聚焦于开发一种高效的乳酸菌碱基编辑系统，希望借此来改进益生菌性能，并深入剖析乳酸菌的基本功能。经过一系列研究，他们成功引入了专门针对乳酸菌的碱基编辑 Target-AID 系统。这一系统可厉害了，它能够在不使用供体 DNA 的情况下，精确地在多个基因组位点引入点突变，就像是给乳酸菌的基因 “做手术”，而且手法极其精准。这一研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上，为乳酸菌的研究和应用开辟了新的道路。
研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。首先是分子克隆技术，用于构建一系列表达关键组件的质粒，这些质粒就像是携带特殊指令的 “小包裹”，被送入乳酸菌细胞内发挥作用。然后通过电穿孔技术将质粒导入乳酸菌中，实现基因编辑。此外，还利用 Sanger 测序技术来分析突变情况，确定编辑效率，就如同给基因做 “体检”，精确检测基因是否被成功编辑。
下面来看看具体的研究结果：
- 开发乳酸菌碱基编辑系统：研究人员构建了一系列质粒，这些质粒表达 nickase Cas9（D10A:nCas9）、PmCDA1 脱氨酶、UGI、crRNA 和 tracrRNA 等关键组件。通过实验发现，在质粒的 crRNA 末端添加终止子（如 E. coli rrnB T1）能显著提高编辑效率。而且，研究还比较了 nCas9 和 dCas9 在该系统中的作用，发现只要含有 UGI，dCas9 版本也能达到与 nCas9 版本相当的编辑效率，这为在一些转化效率低的菌株中进行基因编辑提供了新选择。
- 确定编辑窗口：每个碱基编辑系统都有特定的编辑窗口，研究人员针对 pYK06 在植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）中的编辑窗口展开研究。他们发现，该系统的编辑窗口主要在 17 - 20 位碱基，在这个范围内，碱基转换活性最为显著，而 15 和 16 位的编辑效率相对较低。这一发现虽然揭示了系统的局限性，但也为后续研究指明了方向，比如可以尝试通过采用其他脱氨酶来拓宽可靶向位点。
- 扩大靶向范围：研究人员尝试采用 NG - Cas9 来扩大 Target-AID 系统的靶向范围，开发出 Target-AID-NG 质粒。虽然在构建质粒过程中遇到了一些问题，如间隔序列出现自我编辑，但最终还是成功获得了具有实际可用性的编辑克隆，证明了该系统在扩大靶向范围方面的潜力。
- 实现高效多重碱基编辑：传统的核酸酶介导的多重编辑在细菌中面临诸多挑战，而碱基编辑则具有独特优势。研究人员设计了含有不同数量 crRNA 盒的质粒，实验结果表明，这些质粒能够实现高效的多重碱基编辑，在多个靶向位点都能达到较高的编辑效率（最高可达 100%），且编辑过程互不干扰。这意味着通过一次编辑操作就能在多个基因组位点引入突变，大大提高了基因编辑的效率。
- 系统在不同乳酸菌中的兼容性：研究人员以格氏乳杆菌（Lactobacillus gasseri ATCC 33323）为对象，探究碱基编辑系统的适用性。实验发现，pYK06 质粒在格氏乳杆菌中无法实现碱基转换，而含有双向 PgyrA-Pldh 启动子的 pYK07 质粒则成功实现了碱基编辑。这表明启动子的选择对于在不同乳酸菌中实现成功的基因组编辑至关重要，也证明了 Target-AID 系统具有适应不同乳酸菌物种的潜力。
- 降低咪唑丙酸生成的工程菌株构建：许多乳酸菌含有 urdA 基因，该基因编码的尿刊酸还原酶会产生与 2 型糖尿病相关的咪唑丙酸（ImP）。研究人员利用 pYK06 载体设计靶向 urdA 基因的 crRNA，成功构建出 ImP 产量大幅降低的植物乳杆菌菌株。这些编辑后的菌株生长正常，且发酵牛奶的能力不受影响，为开发有助于控制 2 型糖尿病的益生菌和食品提供了新途径。
- 关键基因的瞬时编辑与功能分析：细胞形态对于共生微生物在肠道生态系统中的定植和稳定性至关重要，而 FtsZ 蛋白是细菌细胞分裂的关键调节因子。研究人员设计了针对 FtsZ 基因的 gRNA，通过编辑该基因引入氨基酸替换或终止密码子。实验观察到编辑后的细胞出现丝状形态变化，表明 FtsZ 功能受到干扰。而且，这些突变不能稳定遗传，呈现出实时编辑的混合群体状态，这为研究具有致死或严重生长缺陷表型的基因功能提供了独特的方法。
在研究结论和讨论部分，研究人员指出，Target-AID 碱基编辑系统能够在乳酸菌中实现高效、精确和多重的基因操作。与传统育种和随机诱变相比，该系统具有明显优势，它可以根据基因组信息理性设计突变，更轻松地将有益性状转移到其他菌株并进行组合。此外，碱基编辑生物在一些主要地区不受转基因生物（GMO）法规的限制，这为其在食品和益生菌领域的应用提供了更广阔的前景。不过，随着基因组编辑技术在食品生产中的应用日益广泛，也需要进行更广泛的伦理和监管讨论，以确保这些技术的合理应用，赢得公众的信任。总的来说，这项研究为乳酸菌的基础研究和应用开发提供了强大的工具，有望推动乳酸菌在食品工业和医疗保健领域取得更大的突破，为人类健康带来更多福祉。
