PAK5：HER2 阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药的关键 “推手”，有望成为新治疗靶点

在 HER2 阳性乳腺癌治疗中，曲妥珠单抗耐药问题突出。研究人员开展 PAK5 在其中作用的研究，发现 PAK5 通过磷酸化 METTL14 促进 MALAT1 的 m6A 修饰和稳定，增加核 HER2（N-HER2）积累，促进耐药。该研究为治疗提供新靶点。

　　在乳腺癌的治疗领域，HER2 阳性乳腺癌是其中较为棘手的一种类型。大约 15 - 20% 的乳腺癌患者属于 HER2 阳性，这类患者的肿瘤往往分化差、侵袭性强。HER2 作为一种跨膜酪氨酸激酶受体，属于人类表皮生长因子（EGF）受体家族。针对 HER2 的靶向治疗，如曲妥珠单抗等单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）等药物的出现，曾给 HER2 阳性乳腺癌患者带来了新的希望。然而，耐药问题却成为了治疗路上的 “拦路虎”，大多数患者最终还是会出现病情进展。目前已知，膜 HER2（M-HER2）过表达在乳腺癌中起着关键作用，现有的抗 HER2 疗法大多针对 M-HER2。但令人困扰的是，核 HER2（N-HER2）在乳腺癌中的作用逐渐受到关注，它不仅是 HER2 阳性肿瘤预后不良的因素，更是曲妥珠单抗耐药乳腺癌的主要增殖驱动因素。可 N-HER2 导致耐药的具体机制却一直模糊不清，这也使得进一步攻克 HER2 阳性乳腺癌的治疗难题变得困难重重。在这样的背景下，为了找到突破困境的方法，中国医科大学的研究人员展开了深入研究。
研究人员发现，p21 激活激酶 5（PAK5）的高表达与 HER2 靶向治疗耐药以及乳腺癌患者的不良预后相关。PAK5 能够磷酸化甲基转移酶 METTL14 的丝氨酸 399 位点，增强长链非编码 RNA 转移相关肺腺癌转录本 1（MALAT1）的 m⁶A 修饰，从而提高 MALAT1 的稳定性。稳定后的 MALAT1 会抑制 N-HER2 的泛素 - 蛋白酶体降解，促进 N-HER2 积累，最终导致曲妥珠单抗耐药。而且，HER2 还能上调 PAK5 和 MALAT1 的表达，形成 HER2 - MALAT1 正反馈回路。此外，研究人员通过体内外实验证实，PAK5 确实能通过增加 N-HER2 蛋白水平，促进 HER2 阳性乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的耐药性。这一研究成果发表在《Cell Death and Disease》上，为 HER2 阳性乳腺癌的治疗开辟了新的方向。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是细胞实验，使用多种乳腺癌细胞系（如 SK-BR-3、BT474、JIMT-1 等）和人胚肾细胞系 HEK-293 进行体外实验；二是动物实验，利用裸鼠构建异种移植瘤模型来观察药物疗效；三是临床样本分析，收集 102 例新鲜冷冻肿瘤及相邻组织、58 例 HER2 阳性乳腺癌患者样本进行检测；四是分子生物学技术，包括免疫印迹（检测蛋白表达）、RNA 免疫沉淀（RIP，研究 RNA - 蛋白相互作用）、甲基化 RNA 免疫沉淀（MeRIP，检测 m⁶A 修饰）等。
下面来看具体的研究结果：

• PAK5 蛋白高水平与 HER2 阳性乳腺癌患者耐药相关：研究人员对 102 例乳腺癌标本进行免疫印迹分析，发现 PAK5 蛋白表达与临床 N 分期、转移及 HER2 状态呈正相关。在 HER2 阳性乳腺癌细胞系中，曲妥珠单抗耐药的 JIMT-1 细胞 PAK5 蛋白水平更高。对 58 例接受曲妥珠单抗治疗的 HER2 阳性乳腺癌患者进行免疫组化染色验证，结果显示 PAK5 高表达患者对曲妥珠单抗耐药，且总生存期（OS）和无病生存期（DFS）较差。细胞实验也表明，过表达 PAK5 会降低 SK-BR-3 和 BT474 细胞对曲妥珠单抗和拉帕替尼的敏感性，而敲低 PAK5 则会增加 JIMT-1 细胞对这两种药物的敏感性。
• PAK5 通过 lncRNA MALAT1 增加 N-HER2 蛋白水平：研究人员发现，PAK5 高表达患者的 N-HER2 表达增加，且 PAK5 高表达与 HER2 核定位正相关。过表达 PAK5 可显著增加 N-HER2 蛋白水平。通过生物信息学预测及实验验证，发现 lncRNA MALAT1 与 PAK5 和 HER2 均有相互作用。临床研究显示，MALAT1 高表达患者对曲妥珠单抗耐药。RNA 免疫沉淀和 qRT-PCR 实验证实 MALAT1 与 HER2 在细胞核内相互作用，过表达 MALAT1 可上调 N-HER2 蛋白水平，且 PAK5 通过 MALAT1 部分上调 N-HER2 蛋白水平，促进曲妥珠单抗耐药。
• MALAT1 招募去泛素化酶 USP8 抑制 N-HER2 泛素蛋白酶体降解并促进其积累：研究发现，MALAT1 几乎不调节 HER2 mRNA 水平，但可通过抑制 N-HER2 的泛素蛋白酶体降解来上调其蛋白水平。预测并验证发现 MALAT1 可通过招募去泛素化酶 USP8，增强 HER2 与 USP8 的相互作用，抑制 N-HER2 泛素化，促进 N-HER2 积累。
• PAK5 是介导 MALAT1 稳定性的新型底物 METTL14 的激酶：qRT-PCR 实验表明，PAK5 过表达上调 MALAT1 表达，敲低 PAK5 则下调其表达。用放线菌素 D 处理细胞发现，PAK5 增强 MALAT1 稳定性。通过质谱分析等实验证实，PAK5 可磷酸化 METTL14 的丝氨酸 399 位点，且 METTL14 是 PAK5 激酶的新型磷酸化底物，可介导 MALAT1 的稳定性和表达。
• PAK5 促进 METTL14 介导的 MALAT1 m⁶A 修饰：RIP 分析和 MeRIP-PCR 实验表明，METTL14 是 MALAT1 的甲基转移酶，可促进 MALAT1 的 m⁶A 修饰，且 PAK5 参与调节这一过程。临床样本检测发现，MALAT1 在乳腺癌组织中高表达。
• PAK5 磷酸化 METTL14 以增强由 lncRNA MALAT1 介导的 N-HER2 积累：转染实验表明，PAK5 的激酶活性及磷酸化 METTL14 对 MALAT1 的表达、稳定性和 m⁶A 修饰至关重要，进而影响 N-HER2 的表达和积累。PAK5 WT 可上调 N-HER2 蛋白表达，增强 USP8 与 N-HER2 的相互作用，而 PAK5 KM 则几乎无此作用。
• PAK5 通过增加 N-HER2 蛋白促进小鼠乳腺癌细胞对曲妥珠单抗的耐药性：动物实验中，将 PAK5 过表达的 SK-BR-3 细胞或对照细胞注射到裸鼠体内，成瘤后给予曲妥珠单抗治疗。结果显示，PAK5 过表达显著减轻曲妥珠单抗对肿瘤生长的抑制作用，肿瘤体积和重量增加，且肿瘤中 PAK5、HER2 和 MALAT1 表达升高，N-HER2 蛋白水平增加。对曲妥珠单抗耐药的 JIMT-1 细胞进行实验，结果与之相反，敲低 PAK5 可增强曲妥珠单抗对肿瘤生长的抑制作用。
  研究结论表明，PAK5 在 HER2 阳性乳腺癌曲妥珠单抗耐药过程中起着关键作用。它通过磷酸化 METTL14，促进 MALAT1 的 m⁶A 修饰和稳定性，进而招募 USP8 抑制 N-HER2 的泛素蛋白酶体降解，导致 N-HER2 积累，最终促进曲妥珠单抗耐药。这一研究首次建立了 PAK 家族成员与 lncRNA m⁶A 修饰之间的联系，系统地阐明了 HER2 阳性乳腺癌靶向治疗耐药过程中 N-HER2 积累的机制，为 HER2 阳性乳腺癌的治疗提供了新的潜在治疗靶点和方向，有望推动相关治疗药物的研发，改善 HER2 阳性乳腺癌患者的预后。