活细胞定量揭示 α - 突触核蛋白对突触蛋白凝聚物粘弹性的调控及意义

在神经科学研究中，突触蛋白（Synapsin）和 α - 突触核蛋白（α - synuclein）凝聚物的材料状态与细胞功能及神经退行性疾病紧密相关，但活体系统中凝聚物材料属性的量化困难重重。研究人员开发 MAPAC 平台研究突触蛋白凝聚物，发现其粘弹性变化大且受 α - 突触核蛋白调控，该成果有助于理解相关疾病机制。

　　在细胞的微观世界里，生物分子凝聚物正逐渐成为科学家们关注的焦点。这些凝聚物通过相分离形成，在各种细胞功能中发挥着关键作用。就像神经元之间的通讯，它高度依赖于突触处突触小泡（SVs）的有序分泌，而突触小泡在突触终扣处聚集形成的凝聚物，就是生物分子凝聚物的典型例子，其主要由突触蛋白家族的蛋白质组装而成。同时，α - 突触核蛋白也会参与到这个凝聚物中，它与突触小泡循环的调节以及神经退行性疾病的发生密切相关。

然而，目前在这个研究领域存在着诸多挑战。其中，一个关键问题是如何准确地量化活体系统中凝聚物的材料属性。以往的研究虽然表明 α - 突触核蛋白在突触蛋白 / SV 组装中起作用，但由于技术限制，无法直接测量它是否以及如何调节突触蛋白凝聚物的材料状态。而且，现有用于研究凝聚物材料属性的技术，如荧光漂白恢复技术（FRAP）、荧光相关光谱技术（FCS）等，都存在一定的局限性，难以在活细胞环境中精确测量凝聚物的材料属性。为了攻克这些难题，深入了解突触蛋白凝聚物的奥秘，来自国外的研究人员开展了一系列研究。

研究人员开发了一种结合微吸管 aspiration（MPA）和全细胞膜片钳（patch - clamp）的技术平台 ——MAPAC。利用这个平台，研究人员对活细胞中的突触蛋白凝聚物进行了深入研究，发现细胞内突触蛋白凝聚物的粘弹性差异巨大，跨度超过四个数量级。而且，这种粘弹性与 α - 突触核蛋白的分配密切相关，α - 突触核蛋白在调节突触蛋白凝聚物的粘弹性方面起着关键作用。这一发现对于理解神经退行性疾病的发病机制具有重要意义，为后续开发相关治疗策略提供了新的理论依据。该研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上。

在研究过程中，研究人员用到了几个主要关键的技术方法。首先是 MAPAC 技术，通过将装有细胞内缓冲液的电极微吸管靠近凝聚物并打破细胞膜，利用吸力使凝聚物流入微吸管，同时记录膜电压以监测细胞内环境稳定性，从而实现对凝聚物材料属性的直接测量。其次是体外重组实验，研究人员在体外构建突触蛋白凝聚物，通过改变突触蛋白结构域和凝聚物环境，探究其材料属性的变化。此外，还运用了光学镊子辅助液滴融合测定法和微吸管 aspiration 技术（MPA），分别用于研究凝聚物的融合特性和材料属性。

研究结果具体如下：

• MAPAC 可直接测量活细胞中的突触蛋白凝聚物：研究人员利用 MAPAC 技术，将微吸管靠近表达荧光标记的突触蛋白和 α - 突触核蛋白的 HEK 293T 细胞中的凝聚物，通过施加吸力使凝聚物流入微吸管进行测量。在测量过程中，记录膜电压发现，当凝聚物进入微吸管时会产生电压跳变（ΔV），这一现象可用于辅助凝聚物的检测。同时，研究表明 MAPAC 技术的稳定性良好，不会因离子泄漏等问题影响测量结果。
• 细胞中的突触蛋白凝聚物具有粘弹性：通过对约 100 个突触蛋白 /α - 突触核蛋白凝聚物的测量，发现其材料响应从明显的粘性液体到粘弹性液体，再到明显的弹性固体不等。研究人员利用三元件粘弹性液体（Jeffreys）模型对凝聚物的响应进行拟合分析，得出细胞内突触蛋白凝聚物的粘弹性是其固有属性，不受荧光标签选择和细胞静息电位的影响，且与周围细胞质的粘弹性有显著差异。此外，测量得到的凝聚物界面张力与体外报道的蛋白质凝聚物界面张力相近，而其粘度明显高于体外观察到的值。
• α - 突触核蛋白在细胞中的凝聚物分配决定了突触蛋白凝聚物的粘弹性：在 HEK 293T 细胞中，α - 突触核蛋白和突触蛋白的表达存在异质性，α - 突触核蛋白的凝聚物分配系数（Π_αSyn）跨度可达两个数量级。研究发现，对于具有可比突触蛋白分配系数（Π_synapsin）的凝聚物，Π_αSyn能准确预测凝聚物在 MAPAC 下的粘弹性响应。凝聚物的粘弹性与 Π_αSyn和 Π_synapsin均呈正相关，但 Π_αSyn对粘弹性的影响更为显著，是调节突触蛋白凝聚物粘弹性的主要因素。
• 突触蛋白结构域和拥挤条件调节突触蛋白凝聚物的粘度和界面张力：研究人员通过体外实验研究了突触蛋白结构域和拥挤条件对凝聚物材料属性的影响。发现全长突触蛋白 1（FL synapsin）的 IDR 单独形成的凝聚物粘度较低，而 PEG 作为拥挤剂，可同时增加凝聚物的粘度和界面张力。减少 PEG 浓度会使 FL synapsin 凝聚物的粘度和界面张力显著降低，但对其毛细管速度影响较小，表明仅测量毛细管速度会忽略 PEG 对凝聚物材料属性的重要影响。
• α - 突触核蛋白以自催化方式增加突触蛋白凝聚物的粘度：在体外实验中，向 FL synapsin 凝聚物中添加纯化的 α - 突触核蛋白，发现 α - 突触核蛋白能显著增加凝聚物的粘度，但对界面张力影响不明显。而且，这种影响呈非线性，随着 α - 突触核蛋白浓度的增加，其在凝聚物中的分配系数（Π_αSyn）增大，表现出同促协同作用，同时凝聚物的大小保持不变。
• 突触蛋白凝聚物在胞质中显著成熟，α - 突触核蛋白加速这一过程：细胞内和体外的突触蛋白凝聚物在粘弹性上存在较大差异，研究人员推测这可能与凝聚物的成熟时间和胞质成分有关。通过延长体外测量时间并添加人胞质进行实验，发现单独的成熟时间不能解释这种差异，而胞质成分和 α - 突触核蛋白共同作用可显著增加凝聚物的粘弹性。在胞质存在的情况下，α - 突触核蛋白能加速凝聚物的成熟，使凝聚物的粘度和弹性显著增加，类似于在细胞中观察到的高粘弹性凝聚物。
• SVs 增加突触蛋白凝聚物的粘度但降低其界面张力：由于突触蛋白凝聚物在组织突触前末端 SVs 储备池方面起着重要作用，研究人员探究了 SVs 对凝聚物材料状态的影响。结果发现，从大鼠大脑中纯化的 SVs 强烈分配到突触蛋白凝聚物中，生理浓度的 SVs 可显著增加凝聚物的粘度，但降低其界面张力。这表明 SVs 在调节凝聚物的形态完整性和 SVs 在储备池中的运输方面发挥着重要作用。

综上所述，研究人员通过 MAPAC 技术和体外重组实验，揭示了 α - 突触核蛋白对突触蛋白凝聚物粘弹性的调控机制。这一研究成果为理解神经元信号传递和神经退行性疾病的发病机制提供了重要的理论基础，也为开发针对这些疾病的治疗方法提供了潜在的靶点。同时，MAPAC 技术作为一种创新的研究工具，为研究其他生物分子凝聚物在活体系统中的行为提供了有力的手段，有望推动生命科学和健康医学领域的进一步发展。