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本文通过系统综述和荟萃分析，研究了多种遗传和环境动物模型中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的调节情况。发现 mTOR 通路失调可能是 ASD 病因的共同机制，Beclin-1 持续下调，表明自噬失调可能是潜在机制，为 ASD 研究提供了新方向。
自闭症谱系障碍（ASD）研究背景
自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder，ASD）是一种神经发育障碍，其特征为沟通和社交互动存在差异，还伴有受限、重复的行为及兴趣。这是一种异质性疾病，在不同个体间症状的严重程度和类型各不相同，且在所有种族和经济群体中均有发生。遗传和环境因素都被认为在 ASD 的发展中发挥作用。据估计，ASD 的遗传度约为 80%，多个基因以及基因与环境的相互作用都对其病因有所贡献。像产前接触丙戊酸等化学物质以及母体感染等环境因素，也与 ASD 风险增加有关。人们认为这些遗传和环境因素干扰了神经发育，导致结构和功能异常，进而使 ASD 患者的突触功能、神经元连接以及脑区之间的沟通发生改变。虽然全基因组关联研究发现了一些与 ASD 相关的基因，这些基因编码的蛋白质与突触形成、传递和可塑性有关，但 ASD 的病因仍未完全明确，因其潜在因素多样且表型表达存在个体差异，被认为具有高度异质性。目前研究虽表明突触可塑性参与其中，但尚未找到 ASD 发展的共同机制。
mTOR 通路在 ASD 研究中的潜在作用
在探寻 ASD 共同机制的过程中，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路受到了关注。mTOR 通路是一条高度保守的信号通路，参与蛋白质合成、细胞生长、代谢和自噬等一系列生理过程，在突触可塑性调节中也起着重要作用。该通路包含两个复合物，即 mTORC1 和 mTORC2，其调节受多种上游信号通路控制，如 GSK3β、TSC1/TSC2、PI3K/Akt 以及各种生长因子和营养物质等。mTORC1 通过 S6K 和 4E-BPs 介导蛋白质合成，还通过 Ulk-1/Beclin/LC-3 自噬通路调节自噬；mTORC2 则参与细胞存活、增殖和肌动蛋白细胞骨架调节等过程，同时还在 mTORC1 上游调节 Akt。
mTOR 通路失调与多种疾病相关，如癌症、阿尔茨海默病、糖尿病和癫痫等，近年来也被发现与神经精神疾病有关。有研究表明，mTOR 信号通过调节神经元棘密度（如突触修剪机制）在 ASD 病因中发挥作用。在 ASD 患者中已鉴定出 mTOR 通路相关基因的变异，在构建的 ASD 动物模型研究中也证实了 mTOR 信号存在异常。然而，mTOR 通路失调是否是 ASD 的基本共同机制，以及 mTOR 信号如何参与其中，仍有待明确。
研究目的与方法
本研究旨在通过对多种遗传和环境 ASD 动物模型进行系统综述和荟萃分析，比较 mTOR 的调节情况。研究过程中考虑了物种、年龄、性别、模型类型和脑区等因素，进行了亚组分析。期望通过找到 mTOR 调节的共同变化，更好地理解 ASD 病因；同时，分析不同动物模型中 mTOR 的差异调节，也有助于认识 ASD 的异质性。
在研究方法上，该综述旨在探究 ASD 动物模型大脑中 mTOR 通路相关蛋白相较于野生型动物的变化情况。研究方案预先在 PROSPERO 注册，报告遵循系统评价和荟萃分析的首选报告项目（PRISMA）清单。通过检索 PubMed 和 Web of Science 数据库获取相关研究，检索词包含动物模型、ASD 和 mTOR 通路相关内容。利用 Rayyan 和 Endnote 软件导入文献记录并去除重复项，随后对剩余文献进行盲法筛选。筛选分两个阶段进行，第一阶段根据预设标准筛选标题和摘要，排除非原创研究、未研究 ASD 动物模型或未分析 mTOR 通路相关蛋白或基因表达的研究；第二阶段对剩余文献的全文进行筛选，进一步排除不符合标准的研究，如未研究遗传或诱导的 ASD 动物模型、未与野生型或对照动物比较、未对至少一种 mTOR 通路相关蛋白或基因进行分子测量以及无全文的研究等。对于遗传 ASD 模型，依据 SFARI 数据库确定相关基因；对于环境诱导模型，纳入丙戊酸（VPA）处理、丙酸（PPA）处理或母体免疫激活等已确立的模型，以及表现出自闭症样行为特征的新模型。
研究人员提取了研究特征和结果数据，包括研究信息、动物模型细节、结果测量指标和测量特征等。对纳入研究的 ASD 模型组和对照组的所有结果测量数据进行提取，包括均值、标准差（SD）或标准误（SEM）以及动物总数（n）。若数据未在文献中明确给出，会使用 WebPlotDigitizer 工具进行提取，必要时还会联系作者获取。提取后的数据会根据年龄组和特定脑区进行标准化处理。
为评估纳入研究的内部有效性，研究人员对潜在的偏倚风险进行了评估。由于系统综述包含大量文献，且预计部分文献因报告不充分存在 “偏倚风险不明确” 的情况，所以随机抽取了 50 篇文献（占 26%），使用 SYRCLE 动物研究偏倚风险工具进行分析。评估项目包括随机化、治疗或分组分配的盲法等，对于基因 ASD 模型研究，部分项目不适用。同时还评估了报告质量相关问题，如是否报告了功效分析、随机化和盲法等。偏倚风险评估由两人独立进行，有分歧时通过讨论解决。
对于至少有两项研究提供数据的每个结果，研究人员进行了荟萃分析。计算标准化均数差（SMD），使用 Hedges’ g 校正，并给出 95% 置信区间（95% CI）。若同一对照组用于多次比较，会对其进行校正；若同一队列报告了多个相似结果，则纳入效应量最高的结果；若样本量报告为范围，则取最小值进行荟萃分析。采用随机效应模型，考虑个体研究的精度和研究间的差异进行加权分析，使用 Comprehensive Meta-Analysis 4.0 软件进行荟萃分析，并通过森林图展示总体效应量和异质性水平（I2）。若每个亚组至少有 10 个独立比较，则进行预设的亚组分析，使用 Q 检验评估亚组间的差异。
为检测潜在的发表偏倚，当每个结局指标的研究数量超过 15 项时，研究人员会在 R 中创建漏斗图，并通过 Duval 和 Tweedie 的修剪填充分析以及 Egger 回归分析评估小研究效应。由于标准化均数差（SMDs）可能导致漏斗图失真，所以将 SMD 与基于样本量的精度估计值（1/√(n)）进行绘制。
研究结果
经过全面检索和严格筛选，在 PubMed 和 Web of Science 数据库中最初检索到的文献去除重复项后，剩余 1137 条记录。经标题和摘要筛选，437 条记录符合进一步评估标准，再经全文筛选，最终 213 篇文章纳入系统综述，192 篇适合纳入荟萃分析和后续偏倚风险评估。
纳入综述的 213 项研究的特征详见补充文件 2。纳入荟萃分析的 192 项研究共产生 793 个比较结果，涉及多种蛋白质。其中，关于（p-）AKT、（p-）S6 和（p-）mTOR 的比较最多，分别有 200 个、118 个和 116 个；其次是 LC3B、（p-）GSK3β 和 Beclin-1。在动物模型方面，大部分比较使用小鼠（636 次），其次是大鼠（151 次），斑马鱼和果蝇各使用 3 次。小鼠模型中，C57BL/6 品系使用最多（439 次），大鼠模型中 Wistar 大鼠使用最多（91 次）。在模型类型上，537 个比较使用遗传模型，127 个使用丙戊酸诱导的 ASD 样表型模型，还有母体免疫激活、干扰母体睡眠、丙酸处理和近交表型模型等环境模型。数据报告中，部分针对雄性（409 次）或雌性（67 次），部分为两性合并（83 次），还有 232 次未指明动物性别。研究中使用的动物大多为青春期（247 次），其次是成年（195 次）、幼年（180 次）和产前（22 次），146 次未报告动物年龄。多数研究采用群居方式饲养动物（44 次），少数单独饲养（3 次），还有 121 次未报告饲养条件。在分子检测方法上，蛋白质印迹法（Western blots）使用最多（631 次），其次是 PCR（82 次）、免疫染色（53 次）、ELISA（23 次）和 RNA 测序（1 次）。分析的脑区主要集中在海马体（348 次）和皮层（182 次），还有全脑分析（98 次）。
使用 SYRCLE 偏倚风险工具对随机抽取的 50 篇文献进行评估发现，在随机序列生成和分配隐藏方面，50 项研究中仅有 1 项报告；动物饲养的随机化在所有研究中均未提及。盲法执行、随机结果评估和盲法结果评估的执行率略高，但仍低于样本的 20%。在报告质量方面，50 项研究中仅有 4 项报告使用功效分析确定合适的样本量，17 项报告了某种形式的随机化，超过 50% 的研究提及了某种盲法。
对至少有两项独立研究比较的每种蛋白质分别进行荟萃分析。在分析的 31 种蛋白质中，13 种在 ASD 模型和对照组之间存在显著差异。PTEN、Beclin-1、LC3-II 和 Rictor 表达降低，而 p-Rictor、p-Ulk1、p-EIF4e、EIF4e、Ulk1、p-mTOR、p-S6K、p-AKT 和 p-S6（磷酸化位点为 235/236）表达增加。这表明 mTOR 通路的上游蛋白以及下游的 mTORC1 和 mTORC2 均发生了相关改变。
若每个亚组至少有 10 个比较，则对每种蛋白质进行亚组分析。部分蛋白质如 p-GSK3β（Ser9 磷酸化）、mTOR 和 p-S6（240/244/245 磷酸化）虽总体效应不显著，但亚组分析发现了显著的亚组效应。Beclin-1 显著下调，在所有亚组中均有一致的显著效应，在环境诱导的 ASD 模型和大鼠模型中的下调作用比遗传模型和小鼠模型更强。LC3-II 总体显著下调，但亚组分析显示仅部分亚组有相同的显著效应，在大鼠模型和环境诱导的 ASD 模型中显著下调，在小鼠模型中不显著。p-Akt 的亚组分析表明，仅海马体脑区和青春期、成年动物组以及环境诱导和遗传模型组有显著效应，在大鼠研究的亚组中未显示显著效应。PTEN 在几乎所有分析的亚组中均显著下调，但全脑区域的效应不显著。p-mTOR 的表达差异高度依赖年龄和脑区，青春期和成年动物以及海马体组织中显著上调，在幼年动物、皮层和全脑分析中不显著。p-EIF4e 在遗传模型和海马体亚组中显著上调。p-S6K 在除皮层组织和青春期动物亚组外的其他分析亚组中均显示显著上调。磷酸化的 S6（235/236 位点）总体显著上调，在小鼠模型和遗传模型亚组中得到证实；而磷酸化的 S6（240/244/245 位点）在所有纳入比较中未显示显著效应，仅在海马体亚组中显著上调。
仅对至少有 15 项独立研究的结局进行发表偏倚分析。漏斗图分析表明部分研究存在不对称性，Egger 回归检验显示 p-AKT 存在潜在发表偏倚。Duval 和 Tweedie 的修剪填充分析为 6 种分析蛋白质（LC3-II、p-eIF4e-bp、p-mTOR、p-S6、p-S6K 和 PTEN）添加了额外数据点，表明存在发表偏倚，且这些蛋白质的汇总效应量可能被略微高估。
研究讨论
本研究旨在探讨 mTOR 失调是否为 ASD 的共同机制，通过分析多种遗传和环境动物模型中 mTOR 通路相关蛋白的调节情况，发现 mTOR 通路失调可能是与 ASD 病因相关的共同机制。Beclin-1 表达在总体和所有可评估的亚组分析中均持续下调，表明自噬失调可能是 ASD 潜在的共同机制。
近年来，mTOR 通路在 ASD 中的作用受到越来越多关注。已有研究发现 ASD 患者中 mTOR 活性增加，动物研究也揭示了 mTOR 失调导致 ASD 病因的多种机制。例如，mTORC1 活性增加可通过磷酸化 4E-BP1 和 S6K1 增加蛋白质合成，改变突触蛋白产生，从而导致 ASD 样表型；同时，mTORC1 活性增加还会抑制自噬，而自噬受损与细胞稳态破坏有关，这也是 ASD 的一个影响因素。
本研究的荟萃分析结果显示，ASD 动物模型中 mTOR 总体活性增加，PTEN、Beclin-1、LC3-II 和 Rictor 表达降低，而 p-S6、p-Ulk1、p-Rictor、p-EIF4e、p-S6K、Ulk1、p-AKT 和 p-mTOR 表达增加。mTORC2 活性增加体现在 p-Akt 和 p-Rictor 的增加上，其他蛋白质则表明 mTORC1 活性增加。mTOR 虽总体效应不显著，但在大鼠、环境模型和海马体亚组中显著上调。这些结果与某些综合征型自闭症（如由 PTEN、TSC1 和 TSC2 基因突变导致 mTOR 过度激活）的情况相符，也表明环境 ASD 动物模型中同样存在 mTOR 过度激活。EIF4e 和 p-EIF4e 表达增加表明 mTORC1 下游的翻译通路上调，在 ASD 患者中也发现 p-EIF4e 水平升高，且在重度患者中更为明显。
尤为重要的是，本研究在蛋白质水平的结果表明，自噬减少是 ASD 的共同机制，这与 mTORC1 活性增加的影响一致。自噬是降解受损蛋白质、维持神经元稳态的重要细胞过程，近期研究发现其与 ASD 儿童的智力能力相关。本研究中 mTORC1 下游的自噬通路总体下调，Beclin-1 在所有分析亚组中均减少，LC3-II 表达也总体降低。Beclin-1 可将 LC3-I 转化为 LC3-II，触发自噬体形成，而 mTORC1 可通过磷酸化 Ulk1（Ser757 位点）使其失活，从而抑制该通路。本研究还发现 p-Ulk1 和 Ulk1 表达增加。在发育过程中，自噬受损可能影响网络组织和突触功能，进而导致 ASD 的行为和认知症状。研究还表明，Beclin-1 和 LC3 等自噬相关蛋白减少可能引发神经炎症，通过促进神经免疫失调进一步加重 ASD 症状。此外，调节 mTOR 通路或使用组胺 H3 受体拮抗剂等恢复 Beclin-1 活性的干预措施，在临床前模型中已显示出缓解部分自闭症相关行为的潜力。
考虑到 ASD 在个体间存在社会、认知和行为症状的临床异质性，找到共同的潜在机制意义重大。本研究纳入多种动物模型，反映了 ASD 的临床异质性。Beclin-1 在遗传和环境诱导的模型以及所有其他亚组中均下调，表明自噬通路可能是一个潜在的研究靶点。
通过亚组分析，研究人员发现 mTOR 调节在物种、年龄、性别、脑区和诱导 ASD 样表型的方式（模型类型）上存在差异。Beclin-1 在所有亚组中均有下调，但在大鼠和环境诱导模型中更为明显；LC3-II 的表达降低主要由大鼠驱动。部分蛋白质的表达增加具有脑区特异性，如 p-S6K、p-S6（240/244/245）、mTOR 和 p-mTOR 在海马体中上调，在皮层亚组中无此现象；PTEN 的下调仅在海马体中显著，这突出了海马体在 ASD 中的作用，但也可能与纳入比较中海马体的主导代表性有关。亚组分析还揭示了年龄依赖性差异，p-mTOR 和 p-Akt 在成年和青春期亚组中表达增加，在幼年亚组中无此现象，表明 mTOR 过度活跃可能在发育后期更为明显；而 p-S6K 和 p-S6（235/236）在仅研究青春期动物时未上调。p-Akt 的上调似乎存在性别特异性，在雌性中下调，在雄性中上调，不过由于大多数研究使用雄性动物或未明确性别，导致雌性代表性不足，这一结果仍需进一步研究，因为 ASD 存在性别差异，且 mTOR 调节可能受雌激素等性激素影响。
本研究分析了 1500 多篇参考文献，最终纳入 213 篇进行综述，192 篇进行荟萃分析。大量证据提高了大多数感兴趣蛋白质研究结果的准确性和可靠性，但对于部分蛋白质（如 Beclin-2、mTOR 激酶、pPTEN、pPTEN、p-Raptor、Rheb、TSC1），纳入荟萃分析的研究数量不足。
研究存在一些局限性。纳入标准仅包括测量直接蛋白质或 RNA 水平的报告，且排除了非英文报告；搜索策略涵盖目前已知的所有 mTOR 相关蛋白，可能遗漏未来研究中发现的新相关蛋白。ASD 模型的定义也可能存在局限，<
