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《Yogurt-inspired hybrid membrane vesicles for the prevention and treatment of Helicobacter pylori infection》一文研发出酸奶启发的混合膜囊泡（hMVs）用于防治幽门螺杆菌（H. pylori）感染。hMVs 能减少细菌黏附、修复胃黏膜屏障、调节免疫和菌群，为抗 H. pylori 感染提供了无抗生素新策略，极具研究价值。
### 研究背景
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H. pylori）是一种革兰氏阴性且具有高传染性的螺旋菌，全球超半数人口受其影响。它主要定植于胃黏膜，是多种胃肠道疾病如慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、十二指肠溃疡乃至胃癌的关键诱因，严重威胁全球公众健康。
目前临床常用联合抗生素方案治疗 H. pylori 感染，主要有三联疗法（质子泵抑制剂、克拉霉素和阿莫西林）和四联疗法（质子泵抑制剂、铋剂、四环素和甲硝唑）。但长期使用抗生素弊端凸显，H. pylori 耐药性增强、根除率下降，还会引发微生物组功能紊乱。世界卫生组织已将耐克拉霉素的 H. pylori 列为需新治疗策略的菌株。因此，开发不依赖抗生素的疗法对减缓耐药性、预防胃肠道疾病意义重大。
H. pylori 借助表面黏附与胃黏膜上皮细胞紧密结合，这一过程依赖与宿主上皮细胞和免疫细胞受体的相互作用，是感染建立和致病的关键，因为游离的病原菌易被免疫系统清除。黏附定植后，H. pylori 通过毒力因子破坏胃黏膜屏障成分，诱导宿主细胞分泌炎症细胞因子，引发黏膜炎症病变，阻碍巨噬细胞清除凋亡细胞，分解上皮细胞的脂筏结构以实现免疫逃逸，最终导致胃炎甚至胃癌。所以，减少 H. pylori 黏附和定植、促进感染胃黏膜修复是可行的非抗生素治疗策略。
宿主细胞膜与病原体（包括细菌和病毒）存在共享的受体 - 配体特征，这为开发抑制黏附和定植的策略提供了思路。细胞外囊泡（EVs）和仿生膜囊泡含有源自宿主细胞膜的天然同源蛋白分子，可有效阻断病原体与宿主间的受体 - 配体相互作用，或捕获中和细菌毒素。其中，革兰氏阴性菌来源的纳米级外膜囊泡（OMVs）能通过表面多种外膜蛋白（OMPs）竞争性抑制细胞黏附，牛奶来源的 EVs（mEVs）可保护肠道屏障完整性，牛奶脂肪球膜（MFGM）富含多种活性分子，有助于维持肠道上皮稳态、调节黏膜免疫和促进黏膜愈合。本研究将细菌来源的 OMVs 与工程化牛奶脂肪球膜囊泡（MMVs）融合，制备出酸奶启发的混合膜囊泡（hMVs），用于防治 H. pylori 感染。
hMVs 的制备与表征
研究选取标准菌株 H. pylori ATCC 43504 获取 OMVs，通过细菌培养基收集、多次洗涤和超速离心进行纯化。将纯化的 OMVs 与经连续挤压获得的 MMVs 融合制备 hMVs。利用透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）对这些囊泡的形态和大小进行表征，结果显示 OMVs、MMVs 和 hMVs 均呈典型囊泡结构，平均大小分别为 173.3nm、186.7nm 和 178.0nm，纳米颗粒跟踪分析（NTA）也得到类似结果。hMVs 的表面 zeta 电位与单一纳米囊泡相比保持稳定，在模拟胃液（SGF）中，其大小至少 48 小时不变，展现出良好的胶体稳定性。
通过用荧光染料标记 OMVs 和 MMVs，经共聚焦可视化观察，证实了 OMVs 和 MMVs 成功融合。十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）表明 hMVs 继承了 OMVs 和 MMVs 的蛋白质成分，斑点印迹进一步确认 hMVs 上存在 H. pylori 特异性蛋白质。蛋白质组学分析的 Venn 图展示了 hMVs 制备过程中蛋白质谱的变化，预测 hMVs 中富集的蛋白质参与细胞黏附、免疫调节等过程。在基于 AGS 细胞单层的抗黏附模型中，确定 OMVs 与 MMVs 的 1:2 混合比例具有显著的抗黏附效果。
hMVs 促进上皮细胞屏障维持及在胃黏膜的积累
为探究 hMVs 与胃上皮细胞的相互作用，研究人员进行了一系列实验。首先评估不同浓度 OMVs、MMVs 和 hMVs 对 AGS 细胞的细胞毒性，结果显示在 0 - 100μg/mL 浓度范围内，hMVs 在 48 小时内对 AGS 细胞的致死率较低，优于单独使用 OMVs。
通过 IncuCyte 扫描和流式细胞术分析发现，hMVs 被 AGS 细胞摄取是一个主动运输过程，在 4 - 6 小时细胞摄取量显著增加。胃黏膜上皮作为抵御有害物质和病原体的重要屏障，其完整性至关重要。划痕实验表明，较高浓度的 hMVs 和 MMVs 能更好地促进 AGS 细胞在 24 和 30 小时的迁移和伤口愈合。
H. pylori 会消耗胃腺中脂筏的胆固醇以逃避炎症反应，而 MMVs 和 hMVs 富含脂筏成分，能增加 AGS 细胞膜中脂筏含量。当 hMVs 浓度大于 50mg/mL 时，可增强 AGS 细胞单层中紧密连接蛋白 ZO - 1 的表达。此外，hMVs 和 MMVs 处理能显著提高巨噬细胞对凋亡 AGS 细胞的吞噬率。给小鼠口服标记的 MVs 后进行体内荧光成像，发现 OMVs、MMVs 和 hMVs 在胃部的积累效果优于对照组，这得益于 MVs 上蛋白质分子的黏附作用。这些结果表明 hMVs 能在体外促进上皮细胞屏障维持，在体内在胃部积累。
hMVs 对 H. pylori 感染的保护作用
在确认 hMVs 体外性能后，研究其体内预防 H. pylori 感染的能力。研究人员建立了 H. pylori 小鼠胃感染模型，通过免疫荧光分析新鲜胃组织冰冻切片，证实了模型构建成功。采用剂量递增的方法评估 hMVs 预防 H. pylori 感染的有效剂量，结果显示蛋白质含量为 200 和 400μg 的 hMVs 能显著降低胃部 H. pylori 感染。
对比不同 MVs 对 H. pylori 感染的保护作用，发现预口服 MVs 可有效预防感染、降低 H. pylori 载量，hMVs 和 MMVs 在维持胃黏膜上皮形态完整性方面表现更优。这表明 hMVs 对 H. pylori 黏附胃黏膜具有预防作用，能协同减轻胃黏膜损伤。
hMVs 修复 H. pylori 感染后的胃黏膜屏障损伤并减少 H. pylori 黏附
研究人员先确定依托泊苷（ETP）可诱导上皮细胞凋亡，然后建立了 C57BL/6 小鼠胃黏膜凋亡与 H. pylori 黏附同步的模型，以评估 hMVs 对 H. pylori 感染的治疗效果。与对照组相比，ETP 诱导的损伤模型出现上皮细胞凋亡、上皮屏障破坏等特征，表现为胃黏膜表面紧密连接蛋白 ZO - 1 表达下降。
利用该模型评估 hMVs 治疗效果，发现 hMVs 具有修复受损胃黏膜屏障和减少 H. pylori 定植的双重作用。与 PBS 处理相比，所有 MVs 都能增加 H. pylori 从胃黏膜的解离，其中 hMVs 对 H. pylori 附着的抑制作用最为显著。在黏膜屏障恢复方面，hMVs 能增加 ZO - 1 蛋白表达，促进胃组织细胞增殖，且小鼠经 MVs 处理后组织形态和血清生化指标正常，表明两周的 hMVs 治疗安全有效。
hMVs 调节 H. pylori 感染后的胃上皮免疫反应
胃肠道黏膜免疫屏障对胃黏膜上皮的系统屏障至关重要。研究评估了 hMVs 对 H. pylori 感染后免疫反应和胃黏膜屏障重建的影响。免疫荧光结果显示，hMVs 和 MMVs 能维持被 H. pylori 定植的胃上皮细胞中脂筏的完整性。
胃上皮细胞表达的细胞因子在免疫反应中起重要作用，其中白细胞介素 - 8（IL - 8）是激活炎症反应的关键趋化因子。口服 hMVs 可降低上皮表面细胞中 IL - 8 的表达，进而减少中性粒细胞的募集。此外，hMVs 处理还能显著降低树突状细胞（DCs）的数量，增加辅助性 T 细胞 1（Th1）的水平，有助于预防 H. pylori 感染，而对巨噬细胞、Th2 细胞等的影响不显著。这些结果表明 hMVs 能有效调节胃黏膜免疫系统，抑制炎症反应。
hMVs 对 H. pylori 感染后胃黏膜微生物群的调节潜力
研究人员对口服 MVs 预防或治疗胃部 H. pylori 感染后的黏膜微生物群进行研究。α 多样性指数分析表明，MVs 干预对治疗或预防 H. pylori 感染小鼠的总体细菌多样性和丰度影响不显著。基于操作分类单元（OTU）水平的差异分析发现，hMVs 干预可促进 H. pylori 感染小鼠胃黏膜细菌 OTU 组成的变化，显著富集了一些潜在的生物标志物。
线性判别分析效应量（LEfSe）结果显示，在属水平上，多种细菌可作为 hMVs 干预抑制 H. pylori 的生物标志物。与 PBS 组相比，hMVs 干预后，一些具有肠道保护作用的细菌相对丰度增加，而部分有害细菌相对丰度降低。相关性分析表明，H. pylori 载量与多种细菌相对丰度相关，维持 ZO - 1 和脂筏与部分细菌相对丰度也存在关联。这表明 hMVs 具有通过调节微生物群抑制 H. pylori、维持胃黏膜完整性的潜力。
研究讨论
本研究构建的 hMVs 可通过减轻 H. pylori 黏附、修复受损胃黏膜屏障来防治 H. pylori 感染。在 H. pylori 感染小鼠模型中，hMVs 在调节 ZO - 1 表达、减少炎症免疫反应和调节微生物群方面优势明显，这得益于其含有的多种活性分子。这种不依赖抗生素的策略在抑制病原体感染方面潜力巨大，减少细菌黏附有助于宿主免疫系统清除病原体，未结合的 hMVs 可能有多种去向。
然而，该仿生范式在转化医学应用中面临挑战。虽然 hMVs 成分简单易获取，制备方法可控，但目前缺乏可靠的给药策略、精确的定量方法，在临床前和临床评估其治疗潜力存在困难。未来应结合相关原则开展体内实验，确定初始剂量等关键参数。
利用 OMVs 和 MMVs 有望为 H. pylori 感染患者提供个性化治疗策略。不同 H. pylori 菌株遗传多态性和致病潜力不同，可从患者中提取特定菌株获取 OMVs，制备定制化 hMVs。还可开发针对常见黏附蛋白的抗黏附治疗药物或靶向给药系统，减少抗生素使用，维持胃肠道微生物稳态。
研究局限性
本研究作为概念验证工作，旨在验证 hMVs 的抗黏附和促进受损黏膜修复能力。单独使用 OMVs 可能存在毒性问题，MMVs 抑制细菌黏附效果欠佳。由于体内毒性是 hMVs 临床转化的关键，目前缺乏长期系统的毒性数据和药代动力学 / 药效学研究。可利用基因工程开发新的非致病性或减毒 H. pylori 生产 OMVs，探索减少 OMVs 副作用的策略，还应研究性别差异对 hMVs 治疗效果的影响，在慢性 H. pylori 感染模型中系统研究 hMVs 的治疗效果，以充分评估其体内安全性和应用潜力。
