探秘李斯特菌噬菌体：多源分离、特性解析与潜在应用新突破

为解决现有李斯特菌噬菌体研究样本量有限、分析不系统的问题，研究人员开展了李斯特菌噬菌体的多源分离及特性研究。他们从多种环境样本中分离出 317 个噬菌体，根据裂解率分为 BHRP、MHRP 和 NHRP 三组，该研究为噬菌体应用提供了资源，具有重要意义。

　　

研究背景

李斯特菌病（Listeriosis）是由单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）引起的严重食源性疾病，病死率高达 20 - 30%。Lm 能在广泛的温度、pH 值和高盐浓度环境中生存繁殖，其 14 种血清型中，1/2a、1/2b、1/2c、4b 等血清型菌株常引发食品污染和人类感染。

噬菌体（Bacteriophages）作为能特异性感染并杀死细菌的病毒，在对抗食源性致病菌和治疗传染病方面极具潜力。然而，目前对李斯特菌噬菌体的研究存在样本量有限、分析不系统的问题，限制了其在生物防治和噬菌体疗法中的应用。为深入了解李斯特菌噬菌体的特性，挖掘其应用潜力，中国疾病预防控制中心传染病预防控制国家重点实验室等机构的研究人员开展了此项研究。

研究方法

1. 样本采集：研究人员从 7 个省份收集了 90 个食品相关环境样本和 196 个自然环境样本，食品相关环境样本包括海鲜、猪肉案板拭子、冷冻食品、市场污水等；自然环境样本涵盖土壤、沙子、泉水、海水等。
2. 菌株准备：选用 31 株菌株（包括 21 株实验室保存菌株和 10 株新分离菌株）用于分离噬菌体，35 株菌株（代表 9 种 Lm 血清型）用于评估噬菌体的裂解活性。
3. 噬菌体分离：样本在添加特定菌株和 CaCl₂的脑心浸液肉汤（BHI broth）中富集过夜，过滤后与分离菌株混合培养，采用双层琼脂法筛选噬菌体，经多次纯化后保存。
4. 宿主范围测试：通过测量 600nm 处光密度（OD₆₀₀）评估噬菌体裂解活性，计算 C 值判断裂解效果，C 值 = （阴性对照孔 OD₆₀₀ - 测试孔 OD₆₀₀） / 阴性对照孔 OD₆₀₀ ，C 值超过 0.22 视为阳性裂解。
5. 血清型特异性裂解率计算：计算噬菌体裂解特定血清型宿主菌株的比例，评估裂解效率。
6. 透射电子显微镜观察：对纯化的噬菌体进行染色处理，用透射电子显微镜观察其形态特征。
7. 统计分析：运用 Wilcoxon 秩和检验分析数据，使用 R 统计计算软件进行统计分析。

研究结果

1. 噬菌体分离：共分离出 317 个李斯特菌噬菌体，其中 57 个来自食品相关环境样本，260 个来自自然环境样本，排除相同裂解谱的噬菌体后，剩余 293 个用于后续分析。
2. 噬菌体与宿主菌株关系：根据总裂解率将噬菌体分为 Broad Host Range Phages（BHRP，裂解率 > 0.85）、Medium Host Range Phages（MHRP，裂解率 0.38 - 0.85）和 Narrow Host Range Phages（NHRP，裂解率 < 0.38）三组。293 个噬菌体中，33 个为 BHRP，204 个为 MHRP，56 个为 NHRP。
3. 不同血清型菌株对噬菌体的敏感性
   • BHRP：多数测试血清型菌株对 BHRP 敏感，但部分菌株如 Lm331（4b）和 Lm258（1/2c）有抗性。
   • MHRP：血清型 4b 对 MHRP 最敏感，1/2b 最不敏感，且 1/2b 菌株对食品相关环境来源的噬菌体敏感性更高。多数 MHRP 能裂解 8 或 9 种血清型菌株，对食品污染和人类李斯特菌病相关血清型菌株也有较高裂解率。
   • NHRP：血清型 4a 和 4b 对 NHRP 敏感性高，其他血清型相对较低。部分 NHRP 能裂解 5 - 7 种血清型菌株，对食品污染和人类李斯特菌病相关血清型菌株也有一定裂解作用。
4. 噬菌体对不同血清型菌株的裂解差异：比较食品相关和自然环境来源的噬菌体，发现 BHRP 中，自然环境来源的噬菌体对 1/2c 菌株裂解率较低，食品相关环境来源的噬菌体对 4c 菌株裂解率较低；MHRP 中，食品相关环境来源的噬菌体对 4a、4c 和 1/2b 菌株裂解率更高；NHRP 中，除血清型 4 菌株外，其他菌株裂解率普遍较低。
5. 噬菌体形态：选取 16 个代表性噬菌体进行透射电子显微镜分析，BHRP 组有 3 个 Siphoviridae 样噬菌体和 5 个 Myoviridae 样噬菌体；MHRP 组有 2 个 Myoviridae 样噬菌体和 2 个 Siphoviridae 样噬菌体；NHRP 组有 4 个 Siphoviridae 样噬菌体。

研究结论与讨论

该研究首次大规模从多种环境样本中分离李斯特菌噬菌体，分析其裂解模式和生态分布，为后续研究提供了宝贵资源。BHRP 具有用于生物防治和噬菌体疗法的潜力，但需进一步研究部分菌株的抗性机制；NHRP 能裂解血清型 4 菌株，可能与细胞壁磷壁酸（WTA）结构有关；食品相关环境来源的噬菌体对某些血清型菌株裂解活性更高，表明食品相关环境可能更利于特定血清型菌株和噬菌体的生存繁殖。

然而，该研究也存在局限性，实验设计不够全面，无法精确测定噬菌体宿主范围，且噬菌体与细菌的共进化可能使宿主范围发生变化。未来还需进一步评估噬菌体的应用潜力，研究细菌对噬菌体的抗性机制，深入了解噬菌体与宿主的相互作用。该研究成果发表在《Virology Journal》上，为李斯特菌噬菌体的研究和应用开辟了新方向，有助于推动食源性疾病防控和噬菌体疗法的发展。