烟酰胺单核苷酸生物合成与 F - 肌动蛋白细胞骨架：调控排卵后老化猪卵母细胞纺锤体组装及成熟质量的关键因素

为探究烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）与丝状肌动蛋白（F-actin）细胞骨架在排卵后老化（POA）诱导的卵母细胞中的关系，研究人员以猪卵母细胞为对象开展研究。结果发现 NMN 可恢复 POA 卵母细胞的成熟能力，该研究为改善卵母细胞质量提供了理论依据。

　　在哺乳动物的繁衍过程中，卵母细胞的成熟质量对受精和胚胎发育至关重要。然而，随着女性年龄增长，卵母细胞会面临排卵后老化（POA）的问题，这使得受精率降低，胚胎质量变差。而且，目前对于 POA 诱导的卵母细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺）与丝状肌动蛋白（F-actin）细胞骨架之间的关系还不清楚。

为了深入了解这一现象背后的机制，来自韩国大邱大学（Daegu University）等机构的研究人员开展了相关研究。他们希望通过研究揭示 NAD⁺补救途径如何通过 F-actin 细胞骨架在 POA 导致的卵母细胞成熟不良中发挥作用。最终研究发现，F-actin 通过烟酰胺单核苷酸（NMN）产生的 NAD⁺进行聚合，是决定卵母细胞质量的关键因素，这一过程通过与纺锤体组装相关的微管来介导。该研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》上，为改善卵母细胞质量、提高辅助生殖技术成功率提供了重要的理论基础，对解决人类生育问题具有潜在的指导意义。

研究人员在实验中主要运用了以下几种关键技术方法：首先，通过延长体外成熟（IVM）时间构建 POA 模型获取实验用猪卵母细胞；其次，运用免疫荧光技术观察 F-actin 和相关蛋白的表达与定位；再者，采用 RNA 测序（RNA-seq）分析差异表达基因；此外，还利用定量聚合酶链反应（qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western blotting）检测相关基因和蛋白的表达水平 。

研究结果如下：

1. F-actin 介导的纺锤体组装和 DNA 损伤：研究人员根据细胞质脂质含量和卵丘细胞扩张情况将猪卵母细胞分为 G1 和 G2 两组，G1 组卵母细胞质量较高，1^stPB（第一极体）排出率和减数分裂成熟率更高。G2 组卵母细胞的 γH2AX 荧光增加，提示 DNA 损伤；ADD1（血影蛋白 1）表达降低，染色体错配和纺锤体异常形成的比率增加；F-actin 荧光表达与 ADD1 表达模式一致。同时，G2 组中衰老标记基因 FAM111A 和 CLU 表达显著升高，细胞骨架相关基因 MAP7 和 SKA1 表达显著降低。由此表明，纺锤体组装导致的微管不稳定会降低猪卵母细胞质量，还可能促使老化标记物的表达增加。
2. POA 卵母细胞成熟率降低：构建 POA 模型后发现，POA 卵母细胞减数分裂成熟率、卵丘细胞扩张程度降低，1^stPB 排出异常，γH2AX 表达增加，提示 DNA 损伤，成熟能力下降。POA 卵母细胞中 ADD1 核表达显著降低，α-tubulin 介导的异常纺锤体组装和染色体错配频率显著升高。RNA-seq 分析和 qPCR 验证结果显示，老化标记基因表达增加，而 MAP7 和 SKA1 表达降低，说明 POA 模型中卵母细胞的成熟进程和减数分裂装置受到破坏，导致卵母细胞质量下降。
3. 猪 POA 卵母细胞微管驱动的减数分裂成熟缺陷：POA 组成熟卵母细胞的皮质 F-actin 表达低于对照组，ADD1 蛋白水平显著降低，Ac-α-tubulin 蛋白水平显著升高。通过 DAVID 分析发现，POA 组与对照组相比，细胞骨架相关基因在微管细胞骨架组织类别中显著富集，老化相关基因在细胞衰老和年龄相关行为衰退类别中显著富集，且 POA 组 NAD 结合和 NAD 代谢过程相关基因表达改变，NAD⁺/NADH 比率显著降低，表明与微管衍生的细胞骨架和 NAD 结合代谢相关的基因是影响猪 POA 卵母细胞的关键因素。
4. NMN 处理后 POA 卵母细胞的 RNA-seq 转录组分析：研究人员将卵母细胞分为 M + NMN、A + NMN、M - A + NMN 等组进行 NMN 处理，RNA-seq 分析和 GO、KEGG 富集分析显示，NMN 处理影响了与细胞骨架和老化相关的基因表达。A + NMN 组中，差异表达基因（DEGs）主要富集在肌动蛋白丝组织、有丝分裂纺锤体组装等类别。热图和蛋白 - 蛋白相互作用（PPI）网络分析进一步表明，微管细胞骨架和 NAD 结合代谢相关基因在 NMN 处理的 POA 卵母细胞的抗衰老和成熟能力中发挥重要作用。
5. NAD 生物合成增加对猪 POA 卵母细胞微管和 F-actin 动力学的影响：NMN 处理 POA 卵母细胞后，卵母细胞的卵周隙（PVS）面积显著缩小，纺锤体 / 染色体结构恢复，皮质 F-actin 得到显著恢复，ADD1 和 Ac-α-tubulin 蛋白水平也恢复。qPCR 结果显示，NMN 处理使 POA 卵母细胞中老化标记基因 CLU 和 FAM111A 表达下调，NAD 相关基因（SIRT1、NMNAT1 - 3）上调，同时恢复了 POA 卵母细胞中降低的 NAD⁺水平。这表明 NMN 补充可改善猪 POA 卵母细胞中微管介导的纺锤体组装和细胞骨架动力学。

研究结论和讨论部分指出，低质量卵母细胞与 POA 卵母细胞具有相似特征，均存在细胞骨架相关的皮质 F-actin 和纺锤体组装缺陷，以及 Ac-α-tubulin 稳定化和老化标记物水平升高。NMN 处理可恢复 POA 卵母细胞中与 NAD 生物合成相关的酶的表达，减轻异常纺锤体组装和老化因子的表达。该研究强调了 NAD⁺耗竭是老化卵母细胞的关键特征，与低质量卵母细胞中老化因子表达增加相似。未来研究可进一步探究激活 NAD⁺生物合成或提高 NAD⁺可用性对老化卵母细胞发育效率的影响，这对于改善体外受精胚胎的发育、解决临床不孕问题具有重要意义。同时，该研究也为深入研究 POA 和女性不孕症提供了重要参考。