Rhodococcus sp. 21391 对 p - 硝基苯酚的降解：双组分单加氧酶的发现与机制解析及其在生物修复中的意义

为解决硝基酚（nitrophenol）污染问题，研究人员开展了关于 Rhodococcus sp. 21391 降解 p - 硝基苯酚（PNP）的研究。结果发现该菌株能高效降解 PNP，且其双组分 p - 硝基苯酚单加氧酶 RsNcpAB 底物特异性广泛。这为生物修复技术发展提供了重要基础。

　　在生态环境的大舞台上，硝基酚（nitrophenol）就像一群不速之客，正肆意破坏着环境的和谐。这些由工业加工、农业径流和不当废物管理等人类活动释放到环境中的物质，毒性高、具有致癌性且易生物积累，已被多国列为优先控制污染物。一旦进入人体血液，硝基酚会将血红蛋白转化为高铁血红蛋白，进而引发肝脏损伤、贫血、呼吸困难等一系列健康问题 。面对硝基酚在环境中频繁出现的严峻形势，寻找高效控制其污染的方法迫在眉睫。

在众多修复策略中，微生物修复因成本效益高、环境友好、适应性强且能原位应用等优势脱颖而出，成为研究的焦点。微生物就像隐藏在生态系统中的 “绿色卫士”，进化出了独特的代谢途径，可将硝基酚转化为危害较小的物质，默默守护着环境的健康。然而，目前对于细菌降解硝基酚的分子机制，科学界的了解还十分有限。

为了深入探索这一神秘领域，东莞理工学院以及中国科学院南海海洋研究所等机构的研究人员展开了一项极具意义的研究。他们的研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，为我们揭开了硝基酚生物降解的新篇章。

研究人员运用了多种关键技术方法来开展这项研究。首先是菌株分离与鉴定技术，他们从中国三亚的红树林土壤中成功分离出菌株，并通过 16S rRNA 测序确定其分类地位。其次，利用基因组测序与注释技术，全面解析菌株的基因信息。同时，运用比较蛋白质组分析技术，对比不同条件下蛋白质表达的差异。此外，蛋白质表达与纯化、酶活性测定、定点突变以及晶体结构测定等技术也为深入探究相关酶的特性和催化机制提供了有力支持。

研究结果如下：

• 高效 PNP 代谢：从红树林土壤中分离出的 Rhodococcus sp. 21391 菌株，如同一位 “高效清洁工”，能以 PNP 为唯一碳源生长繁殖，在无诱导条件下，18 小时内可完全降解 300 μM 的 PNP，并释放等量的亚硝酸根离子 。在利用 PNP 过程中，还观察到中间产物对硝基邻苯二酚（p-nitrocatechol） 。该菌株对高浓度 PNP 耐受性强，48 小时内可完全降解 1300 μM 的 PNP 。16S rRNA 测序分析表明，该菌株属于放线菌门红球菌属，与 Rhodococcus opacus 1CP 的序列同一性高达 99% 。此外，菌株对 PNP 具有明显的趋化性，且能有效降解多种苯系化合物，展现出其在苯代谢方面的巨大潜力。
• PNP 代谢基因簇鉴定：Rhodococcus sp. 21391 基因组全长 9.42 Mb，包含众多与苯化合物代谢相关的基因 。研究人员从中确定了 PNP 降解基因簇，该基因簇由四个基因（p - 硝基苯酚单加氧酶氧化组分、黄素还原酶、羟基喹啉 1,2 - 双加氧酶和马来酰乙酸还原酶）和一个编码 TetR 转录负调控蛋白的基因 pnpR 组成 。经 PNP 诱导后，菌株降解 PNP 的效率显著提高，同时关键酶的表达也发生明显变化，这表明该基因簇在 PNP 降解过程中发挥着重要作用。
• 双组分 PNP 单加氧酶的生化特性：双组分单加氧酶 RsNpcAB 在 PNP 代谢的初始氧化步骤中起着关键作用，是 PNP 降解的限速过程 。研究人员在体外表达并纯化了该酶的两个组分 RsNpcA 和 RsNpcB 。RsNpcB 可接受 NADH 和 NADPH 作为电子供体，使用 FAD 或 FMN 作为电子受体，且 NADPH 的周转速率比 NADH 高两倍 。RsNpcA 在 25°C 和 pH 7.5 时活性最高，其底物谱广泛，不仅能高效氧化硝基酚，还可利用多种对卤代酚作为底物 。虽然 RsNpcAB 对 PNP 的亲和力与其他菌株的相关酶相当，但其催化效率较低，导致菌株代谢 PNP 的速度较慢。不过，RsNpcAB 是首个被报道能降解卤代酚的双组分单加氧酶，这一特性极大地拓展了其在生物技术领域的应用潜力。
• RsNpcA 催化的结构和分子机制：研究人员成功测定了 RsNpcA 的晶体结构，分辨率为 2.4 ?，空间群为 I4₁22 。通过与其他相关酶结构的比对，确定了 RsNpcA 的潜在底物结合位点和关键催化残基 。定点突变实验表明，Arg100 和 His293 在酶催化过程中起着至关重要的作用，基于此提出了 RsNpcA 的催化机制模型。

研究结论和讨论部分指出，Rhodococcus sp. 21391 菌株在降解 PNP 方面表现卓越，8 小时内可诱导降解 300 μM 的 PNP，远超先前报道的菌株 。其广泛的代谢多样性和对高浓度 PNP 的耐受性，使其成为处理酚类污染工业废水生物修复的理想候选菌株 。此外，研究还发现 RsNpcAB 具有独特的催化特性，其广泛的底物谱为生物催化领域的发展提供了新的思路 。同时，对 Rhodococcus sp. 21391 趋化性相关基因的发现，也为深入研究其在环境中的行为提供了方向 。

这项研究不仅发现了高效降解 PNP 的菌株和酶，还从分子层面揭示了其降解机制，为理解细菌降解硝基酚提供了重要依据，更为开发高效的生物修复技术奠定了坚实基础，在环境科学和生物技术领域具有重要的理论和实践意义。