一种诱导微小 RNA miR-124 的药物可促使维甲酸耐药神经母细胞瘤细胞分化：开启神经系统癌症治疗新希望

《Science Signaling》：A drug that induces the microRNA miR-124 enables differentiation of retinoic acid–resistant neuroblastoma cells

《一种诱导微小 RNA miR-124 的药物可促使维甲酸耐药神经母细胞瘤细胞分化》一文，筛选出可激活 miR-124 的小分子药物 PP121。它与 bufalin 联用，能抑制维甲酸耐药的间充质（MES）神经母细胞瘤细胞增殖、促进分化，为治疗高危神经母细胞瘤提供新策略。

　　

神经母细胞瘤的现状与挑战

神经母细胞瘤（Neuroblastoma）起源于神经嵴细胞（NCCs），是儿童最常见的颅外实体瘤。患者临床症状、治疗反应、预后及肿瘤特征差异大，低 / 中危患者 5 年生存率超 95%，高危患者却低于 50%。

神经母细胞瘤细胞系形态多样，可分为 “N” 细胞和 “S” 细胞。借助下一代测序技术，又能将其分为肾上腺素能（ADRN）细胞和更不成熟的间充质（MES）细胞。MES 细胞对化疗、维甲酸（RA）治疗、靶向间变性淋巴瘤激酶的抑制剂及靶向二唾液酸神经节苷脂的治疗性抗体均有耐药性，且在复发性肿瘤中富集，因此急需有效针对 MES 细胞的治疗方法。

微小 RNA（miRNAs）可调节基因表达，在细胞进程中意义重大。miR-124 在神经系统中含量丰富，是神经元分化和轴突生长的驱动因素，在多种癌症中常下调，被视为关键肿瘤抑制因子。在神经母细胞瘤细胞中，内源性 miR-124 在 RA 诱导分化时上调，转染 miR-124 模拟物可促进神经元分化，且 MES 细胞系中 miR-124 表达远低于 ADRN 细胞系。基于此，研究人员推测上调 miR-124 的分子通路或许能推动 MES 神经母细胞瘤细胞分化。

研究发现与成果

研究人员利用此前高通量筛选小分子 miRNA 调节剂的资源，寻找能上调 miR-124 的化合物，并测试其对细胞增殖和分化的影响，尤其是在 RA 耐药的 MES 细胞系中。他们验证了酪氨酸和磷酸肌醇激酶双抑制剂 PP121 可激活 MES / 异质性神经母细胞瘤 SK-N-AS 细胞中的 miR-124。

实验中，研究人员先选用对 RA 诱导神经元分化有抗性且细胞组成混合的 SK-N-AS 细胞系。转染 miR-124 模拟物后，SK-N-AS 细胞出现神经元样细胞，细胞活力和汇合度降低，MES 的 GI-ME-N、SH-EP 等细胞系也有类似变化，表明外源性 miR-124 可抑制 MES 细胞增殖并诱导分化。接着，研究人员筛选出 22 种可能诱导 miR-124 表达的候选化合物，用它们和 RA 处理 SK-N-AS 细胞。结果显示，PP121 处理的细胞停止增殖、形态拉长并长出神经突样突起，且 PP121 以剂量依赖方式上调 miR-124 水平，主要影响增殖细胞，其诱导的细胞变化可逆。

为进一步诱导 SK-N-AS 细胞分化，研究人员改良了 RA 诱导 SH-SY-5Y 细胞分化的方法，用 PP121 替代 RA，却出现细胞结块问题。加入 BDNF 激活剂 bufalin 后，细胞结块现象消失，还促进了神经突样突起生长。最终确定的分化方案分两步：先在含 PP121 的培养基中培养，再换用含 PP121 和 bufalin 的培养基，定期补充新培养基。经此处理，SK-N-AS 细胞出现非运动性的衰老样细胞和运动性的神经元样细胞，增殖标记物 KI67 消失，神经元标记物 TUJ1⁺ 突起增长，显示出神经元分化特征。

为探究 PP121/bufalin 诱导 SK-N-AS 细胞分化的分子机制，研究人员进行 RNA 测序分析。结果发现，分化细胞中与细胞增殖相关的基因下调，与 MES 细胞相关的转录因子（TF）PRRX1 上调，与 ADRN 细胞相关的 TF 如 PHOX2A、PHOX2B 下调，且与神经元状态相关的基因也下调，而与炎症相关的基因上调。通过 K^-means 聚类和 Reactome 通路富集分析发现，分化过程涉及细胞周期、转录、翻译等过程的变化，以及细胞外通讯和炎症反应的增强，但长期分化的细胞在转录水平上并未获得神经元命运。

从转录因子变化来看，ADRN 相关 TF 随时间下调，MES 相关 TF 呈波浪式上调。结合已有的神经母细胞瘤数据集进行基因签名分析发现，SK-N-AS 细胞在分化过程中逐渐向 MES 表型转变，且免疫激活基因和衰老相关基因富集，免疫荧光分析也证实了这一点。在蛋白质水平，MES 相关 TF 增加，ADRN 相关 TF 减少，与转录水平变化一致。

对比 PP121/bufalin 处理的细胞和 RA 诱导分化的细胞发现，二者下调基因的通路有重叠，但上调基因的通路重叠较少，且 PP121/bufalin 处理的细胞中与视黄醛 - 交感神经回路相关的 TF 下调或不变，表明其诱导的分化与 RA 诱导的不同。研究人员推测 PP121/bufalin 可能促进细胞向嗜铬细胞谱系分化，分析发现驱动嗜铬细胞发育程序的 TF 显著上调。利用 CIBERSORTx 进行去卷积分析显示，分化过程中循环神经母细胞减少，嗜铬细胞和施万细胞前体（SCPs）增加，但这些细胞更像嗜铬细胞和 SCPs 的中间形式。

研究人员还发现，将 PP121 和 bufalin 直接加入生长培养基的一步法可诱导多种 MES 型神经母细胞瘤细胞系（如 GI-ME-N、SH-EP 等）和胶质母细胞瘤细胞系（如 U-251、LN-229）长期分化。对分化后的细胞进行分析发现，增殖标记物 KI67 减少，且基因表达变化与患者预后相关，与不良预后相关的基因下调，与良好预后相关的基因上调，表明该处理可能改善患者预后。

分化机制的探究

对于 PP121/bufalin 诱导细胞分化的机制，研究人员提出三种潜在互补机制。其一，PP121 可能通过上调 miR-124 诱导分化。在分化的 SK-N-AS 和 GI-ME-N 细胞中，miR-124 持续上调，其直接靶基因如 EZH2、PHF19、CDK4 和 CDK6 等下调，相关蛋白水平也降低，且在某些细胞系中，分化还可能调节 MYCN 表达。其二，PP121 和 bufalin 可能通过已有的、不依赖 miRNA 的作用机制诱导分化。对终末分化细胞的基因分析发现，共享的下调基因与 CDK4/6 抑制剂和 CDK4/6 CRISPR 敲除（KO）相关基因富集，共享的上调基因与强心苷和 TTK CRISPR KO 相关基因富集，强调了 CDK4/6 抑制在分化机制中的重要性。其三，表观遗传修饰在分化中可能起重要作用。PP121 诱导分化细胞的核伸长，与 MES 和表皮干细胞分化及染色质重塑相关，表明表观遗传修饰参与其中。此外，PP121 对不同细胞系的作用不同，它可杀死 ADRN 型细胞或促使其转化为 MES 型细胞，而 MES 型细胞则存活并分化，这解释了 SK-N-AS 细胞和 GI-ME-N 细胞在分化过程中的不同表现。

研究意义与展望

本研究利用 PP121 和 bufalin 的协同作用，成功诱导并维持了 SK-N-AS 细胞的长期分化，且该方法对其他 MES 神经母细胞瘤细胞系和胶质母细胞瘤细胞系也有效。分化后的细胞具有嗜铬细胞和 SCPs 的特征，与 RA 诱导的晚期神经母细胞瘤亚型不同。这一简单通用的方法为高危、MES 型神经母细胞瘤的治疗提供了新方向，相关研究表明，嗜铬细胞表型与肿瘤静止、侵袭性降低有关，进一步凸显了该分化方案的临床潜力。此外，长期存活的分化细胞可作为研究细胞分化、成熟、炎症、衰老及对治疗药物反应等过程的宝贵模型。

然而，本研究也存在局限性。使用的永生细胞系无法完全模拟患者来源细胞的异质性，批量 RNA 测序也不能充分捕捉神经母细胞瘤细胞群体的异质性。未来研究可使用患者来源的原代细胞和单细胞分析技术，深入探究神经母细胞瘤进展和分化的动态过程，尤其是表观遗传机制。同时，虽然 PP121 和 bufalin 在抑制癌细胞生长方面有潜力，但需在动物模型中验证其联合使用的效果，并探索如何降低毒性，特别是在儿科患者中的应用，以减少传统治疗的长期副作用，推动基础科学研究和临床干预的发展。