调控胞内 NADH 水平提升枯草芽孢杆菌 Z2 纤维素酶生物合成：开启生物质高效转化新征程

《iScience》：Enhancing cellulase biosynthesis of Bacillus subtilis Z2 by regulating intracellular NADH level

为优化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）纤维素酶生物合成，研究人员开展了调控胞内 NAD+/NADH 水平的研究。通过模块化工程策略筛选相关基因，发现共表达 ycel、nadV、nadM 和 mdh 可显著提升纤维素酶活性。该研究揭示了调控机制，为提升酶产量提供新途径。

　　在生物能源与化工领域，木质纤维素作为丰富且可持续的资源，本应在生物燃料和化学品生产中大放异彩，然而其酶水解过程却因纤维素酶消耗量大，成为产业发展的 “拦路虎”。降低纤维素酶生产成本、提高其产量迫在眉睫。在此背景下，重庆大学的研究人员挺身而出，开展了 “Enhancing cellulase biosynthesis of Bacillus subtilis Z2 by regulating intracellular NADH level” 这一研究，相关成果发表于《iScience》 。该研究意义重大，有望打破现有困境，为木质纤维素的高效利用开辟新道路。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：基因工程技术，对涉及 NAD⁺生物合成和 NADH 再生的 13 个基因进行操作；构建重组菌株，将不同模块基因导入枯草芽孢杆菌 Z2；酶活性和生物质检测技术，测定滤纸水解酶（FPase，代表总纤维素酶）和羧甲基纤维素酶（CMCase，代表内切葡聚糖酶）活性及生物质浓度；分子生物学技术，如 RNA 分离、逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析基因转录水平，蛋白质免疫印迹（SDS-PAGE）测定蛋白质表达水平；代谢物检测技术，检测细胞内 NAD (H/⁺) 水平、NAD⁺/NADH 比值，以及烟酸（Na）和烟酰胺（Nm）的消耗情况。

研究结果

1. 模块化设计策略提升胞内 NAD (H/⁺) 水平：研究人员将 NAD⁺生物合成和 NADH 再生途径分为四个代谢模块。模块 1 通过改造内源性基因 nadB、nadA 和 nadC 增强 L - 天冬氨酸（L-Asp）同化和 NAD⁺合成；模块 2 利用 ycel 编码的 niaP 转运蛋白，同化烟酸（Na）和烟酰胺（Nm），构建补救途径，并引入外源基因 nadV 和 nadM 缩短 NAD⁺合成路径；模块 3 过表达 nadD 和 nadE 促进 NaMN 向 NAD⁺转化；模块 4 构建 TCA 循环相关基因 mdh、icd 和外源基因 sucB，增强 NADH 再生。
2. NAD⁺生物合成模块优化：
   • 从头合成途径（模块 1）：分别过表达 nadB、nadA 和 nadC，结果显示重组菌株的纤维素酶活性、生物质、胞内 NAD (H/⁺) 水平和 NAD⁺/NADH 比值与野生型（WT）相比变化不大，表明枯草芽孢杆菌纤维素酶活性和 NAD⁺生物合成对这些基因过表达不敏感。
   • 补救合成途径（模块 2）：过表达 ycel、pncA 和 pncB，发现过表达 ycel 的 Salvage Na-1 菌株纤维素酶活性和生物质显著提高，胞内 NAD (H/⁺) 和 NADH 水平升高，NAD⁺/NADH 比值不变。同时，单独或同步过表达 nadV 和 nadM，发现同步表达的 SalvageNm-3 菌株纤维素酶活性、胞内 NAD (H/⁺) 和 NADH 水平显著增加，说明该捷径途径可促进代谢通量向 NAD⁺合成。因此，选择 ycel、nadV 和 nadM 进行后续模块化组装。
   • 通用合成途径（模块 3）：过表达 nadD 和 nadE，重组菌株的各项指标与 WT 几乎相同，表明这些基因过表达对 NAD⁺生物合成和纤维素酶活性影响较小。
   
   
3. NADH 再生模块优化：过表达 TCA 循环中的 mdh、icd 和 sucB，结果显示单独或同步过表达 mdh 和 sucB 可增强枯草芽孢杆菌纤维素酶活性，胞内 NADH 水平显著增加，NAD⁺/NADH 比值降低。由此推断，胞内 NADH 水平增加和 NAD⁺/NADH 比值降低可刺激纤维素酶产生，故选择 mdh 和 sucB 进行后续模块化组装。
4. 调控模块整合对胞内 NADH 水平和纤维素酶生物合成的影响：将 ycel、nadV、nadM、mdh 和 sucB 五个基因进行组装，构建六个工程菌株。其中，共表达 ycel、nadV、nadM 和 mdh 的 BA-4 菌株纤维素酶活性最高，分别是 WT 的 2.24 倍（FPase）和 2.04 倍（CMCase），生物质和纤维素酶活性 / 生物质也显著增加。但共表达五个基因的 BA-5 菌株纤维素酶活性最低，可能是由于细胞内过量 NADH 产生 “还原应激”，导致 ROS 积累，打破细胞内稳态平衡。此外，研究发现胞内 NADH 水平可能通过调节胞质 Ca²⁺水平影响纤维素酶活性。
5. 钙信号通路对纤维素酶基因表达的调控：通过添加 Ca²⁺通道阻滞剂 LaCl₃和敲除 spcF 基因，研究发现阻断 Ca²⁺内流或敲除 spcF 基因可显著降低纤维素酶活性和纤维素酶相关基因 eglS 和 bglC 的表达水平，表明钙信号通路参与了枯草芽孢杆菌 Z2 中纤维素酶相关基因的过表达调控。

研究结论与讨论

本研究采用模块化合成生物学策略，成功促进了枯草芽孢杆菌纤维素酶的生物合成。通过调控代谢通量提高胞内 NAD (H/⁺) 水平，鉴定并过表达了对纤维素酶活性有显著影响的关键基因。其中，重组菌株 BA-4 中 ycel、nadV、nadM 和 mdh 的共过表达，大幅提高了胞内 NADH 水平和纤维素酶活性。研究还揭示了胞内 NADH 水平通过钙信号通路调节纤维素酶相关基因表达的机制，为深入理解纤维素酶生物合成调控网络提供了新视角。

然而，该研究也存在一定局限性。研究仅针对枯草芽孢杆菌 Z2，其结果在其他微生物系统中的普适性有待探索；工程菌株在工业条件下的长期稳定性和可扩展性未评估；除钙信号通路外，其他潜在调控机制未研究；多基因过表达对细胞适应性和生长的代谢负担未充分评估；该策略在大规模工业应用中的环境和经济可行性也需进一步研究。尽管如此，本研究为提高纤维素酶产量提供了新方法，为枯草芽孢杆菌纤维素酶生物合成调控机制的研究奠定了基础，有望推动生物技术在木质纤维素转化领域的应用和发展。