靶向鼠伤寒沙门氏菌致病关键调控因子的合成小分子的发现及其意义

《SCIENCE ADVANCES》：Discovery of synthetic small molecules targeting the central regulator of Salmonella pathogenicity

为解决抗生素耐药问题，研究人员开展针对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）致病机制的研究。他们发现合成小分子 C26 能抑制效应蛋白分泌，阻碍细菌入侵。这为开发抗沙门氏菌感染的药物提供了新方向。

　　在全球公共卫生领域，抗生素耐药性问题日益严峻，这给人类健康带来了巨大挑战。据统计，2019 年全球约有 127 万人死于抗生素耐药性细菌感染。在众多致病菌中，鼠伤寒沙门氏菌作为一种常见的肠道病原体，可引发炎症性腹泻，部分菌株还能导致侵袭性感染，严重威胁人类和动物的健康。传统抗生素在应对这些感染时，由于耐药性问题效果逐渐减弱，因此，开发新的抗沙门氏菌感染策略迫在眉睫。

在此背景下，研究人员开展了针对鼠伤寒沙门氏菌致病机制的研究。鼠伤寒沙门氏菌入侵宿主细胞并引发疾病，主要依赖其分泌系统分泌的效应蛋白。这些分泌系统由特定的基因编码，而 HilD 作为关键的转录调节因子，在调控这些基因表达中起着核心作用。因此，研究人员将目光聚焦于靶向 HilD 的小分子抑制剂的研发，期望能找到新的抗沙门氏菌感染的药物靶点。

研究人员通过虚拟筛选和表型筛选相结合的方法，对大量化合物进行研究。他们从约 470,000 种商业化合物中筛选出 49 种可能的抑制剂，最终确定了化合物 C26。C26 是一种具有类药性质的小分子，其分子量为 397.3Da，具有N- 苄基氨基乙酰胺核心结构。

研究结果如下：

• T3SS-1 抑制剂的鉴定：通过监测效应蛋白 SipA 的分泌，确定 C26 为最有效的化合物。它能抑制 SipA 分泌，半数抑制浓度（IC₅₀）为 29.2μM，且不影响细菌生长。在细胞实验中，C26 对 HeLa 细胞的毒性较低，在小鼠实验中也未观察到明显的不良反应。此外，C26 能显著降低 SipA 向 HeLa 细胞的注射水平，且在细菌感染宿主细胞时加入 C26 也能快速抑制 SipA 注射。
• C26 对毒力基因表达和真核细胞侵袭的影响：Western blotting 分析表明，C26 能剂量依赖性地减少 T3SS-1 分泌蛋白 SipA、SctE 和 SctP 的分泌和表达。RNA 测序结果显示，C26 能下调多个毒力岛（SPI）编码的基因，包括 SPI-1、SPI-4 和 SPI-2。此外，C26 还能抑制 SPI-4 编码的 T1SS 和 SPI-2 编码的 T3SS-2 的活性，从而阻碍鼠伤寒沙门氏菌对 HeLa 细胞和 MDCK 细胞的侵袭。
• C26 的分子靶点鉴定：通过构建报告基因系统，研究人员发现 C26 能抑制 HilD 的活性，其半数抑制浓度（IC₅₀）为 16.9μM。纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）显示，C26 与 HilD 具有较高的亲和力，且对 HilC 无明显影响。电泳迁移率变动分析（EMSA）表明，C26 能抑制 HilD 与 DNA 的结合，且不破坏其寡聚化状态，其抑制机制与其他已知的 HilD 抑制剂不同。
• HilD 的可药性分析和结构特征：生物信息学分析显示，HilD 在脊椎动物基因组中无相似序列，且 C26 对其具有选择性。通过 AlphaFold2 模拟和核磁共振（NMR）光谱等技术，确定了 C26 与 HilD 的结合口袋和潜在的结合模式。
• HilD-C26 复合物的结构表征：氢氘交换质谱（HDX-MS）分析表明，C26 与 HilD 结合后，会引起 HilD 结构的变化，影响其与 DNA 的结合。通过定点突变实验，进一步验证了 C26 与 HilD 结合口袋中关键氨基酸的作用。
• 活性谱分析：对 2351 个 HilD 序列的分析发现，常见的氨基酸替代突变对 C26 的敏感性无显著影响。此外，C26 对多种临床分离株具有抑制活性，且其活性不受菌株的分离来源、序列类型和抗生素耐药性的影响。
• 结构 - 活性关系（SAR）分析：对 C26 进行结构修饰后发现，5 - 溴噻吩 - 2 - 基单元对其活性至关重要，部分修饰后的化合物活性增强。细胞摄取实验表明，C26 及其类似物的活性受细胞摄取和与 HilD 结合的共同影响。

研究结论和讨论部分指出，本研究发现的 C26 具有良好的类药性质和活性，为开发治疗沙门氏菌感染的药物提供了新的方向。与传统抗生素不同，靶向毒力因子的小分子抑制剂可能降低细菌耐药性的产生风险。C26 能抑制感染巨噬细胞内沙门氏菌效应蛋白的分泌，这对于治疗革兰氏阴性菌引起的细胞内感染具有重要意义。以 C26 为支架进行结构优化，有望开发出更有效的抗沙门氏菌感染的药物，用于预防和治疗人类和动物的沙门氏菌感染。

研究人员在开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。在筛选抑制剂方面，采用虚拟筛选和表型筛选相结合的方式，从大量化合物中筛选出潜在的 T3SS-1 抑制剂。在确定 C26 的作用机制和靶点时，使用了多种实验技术，如蛋白质纯化与分析技术，包括重组蛋白表达纯化、电泳迁移率变动分析（EMSA）等，用于研究蛋白质与 DNA 的结合；生物物理技术，如纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）、氢氘交换质谱（HDX-MS）等，用于分析蛋白质的结构和相互作用；以及细胞和动物实验技术，如细胞毒性实验、细菌侵袭实验等，用于评估化合物的生物学活性和毒性。此外，还通过 RNA 测序技术分析基因表达变化，利用定点突变技术探究关键氨基酸的作用。这些技术相互配合，为深入研究 C26 的作用机制和开发新的抗沙门氏菌药物奠定了基础。