水稻中 OsSTRK1 通过磷酸化 OsGSK2 调控油菜素内酯信号通路：解锁植物生长发育的关键密码

《Cell Reports》：The receptor-like cytoplasmic kinase OsSTRK1 regulates brassinosteroid signaling by phosphorylating OsGSK2

这篇研究发现水稻受体样胞质激酶（OsSTRK1）能与 OsGSK2 相互作用并磷酸化它，抑制油菜素内酯（BR）信号传导，影响水稻生长发育。该研究揭示了 BR 信号通路新机制，为作物生长调控提供理论依据，对农业研究意义重大。

　　### 引言
油菜素内酯（Brassinosteroid，BR）是一种类固醇植物激素，在植物生长、发育以及应对生物和非生物胁迫等众多生物学过程中发挥着关键作用。在拟南芥中，BR 信号通路研究较为深入，质膜定位的 BR 受体 BRI1 及其共受体 BAK1 能感知并结合 BR，进而激活 BRI1。随后，BRI1 磷酸化下游激酶 BSKs 和 CDG1，它们再结合并磷酸化磷酸酶 BSU1。磷酸化的 BSU1 可使 BIN2 的酪氨酸残基去磷酸化，抑制其激酶活性，促使 BIN2 被蛋白酶体降解，从而推动 BR 信号转导。

糖原合酶激酶 3（Glycogen synthase kinase 3，GSK3）- 样激酶是 BR 信号的关键负调控因子。在拟南芥中，磷酸化的 BIN2 作为 GSK3 - 样激酶的活性形式，可磷酸化并使下游同源转录因子 BZR1 和 BZR2/BES1 不稳定，进而抑制 BR 信号。在水稻中，OsGSK2 作为 BIN2 的同源物，同样通过负调控 OsBZR1 来抑制 BR 信号。此外，GSK3 - 样激酶在茉莉酸、独脚金内酯和生长素等其他激素信号通路中也起着重要作用，其活性、稳定性和定位受多种蛋白调控。然而，在 BR 信号通路中，能够磷酸化 GSK3 - 样激酶的激酶身份一直未知。

受体样激酶（RLK）基因家族在水稻中约有 1131 个成员，其中受体样胞质激酶（RLCK）是 RLK 的一个超家族，它在激酶结构域与 RLK 具有同源性，但缺少跨膜结构域。RLCK 参与多种信号通路、植物生长和胁迫响应过程。例如，OsSERK2 正调控由 XA21、XA3 和水稻免疫受体 FLS2 介导的免疫反应；细胞壁相关的 RLK WAK10 突变会影响茎干细胞厚壁组织的细胞壁加厚和细胞扩张；OsSTRK1 参与赋予水稻非生物胁迫耐受性，并在盐和氧化胁迫下介导水稻生长。本研究聚焦于 OsSTRK1，探究其在水稻 BR 信号通路中的作用机制。

结果

1. OsSTRK1 与 OsGSK2 相互作用：为了寻找与 OsGSK2 潜在相互作用的蛋白，研究人员进行了酵母筛选实验，发现 OsSTRK1 能与 OsGSK2 相互作用。酵母双杂交（Y2H）实验表明，OsGSK2 可与 OsSTRK1 相互作用，进一步将 OsSTRK1 分为 N 端区域、激酶结构域和 C 端区域进行 Y2H 实验，结果显示激酶结构域和 C 端对于二者在酵母中的相互作用均是必需的，但单独的激酶结构域不能与 OsGSK2 相互作用。免疫共沉淀（co - IP）实验进一步证实了在水稻原生质体中，OsGSK2 - MYC 和 OsSTRK1 - HA 能形成复合物。分裂荧光素酶互补（Split - LUC）实验和 GST pull - down 实验分别在烟草叶片和体外证明了二者的相互作用，双分子荧光互补实验还显示该复合物定位于质膜。通过分析公共表达谱数据和 RT - qPCR 实验，发现 OsGSK2 和 OsSTRK1 在转录水平上均在多种组织中表达。
2. OsSTRK1 在 Tyr - 223 位点磷酸化 OsGSK2：鉴于 OsSTRK1 和 OsGSK2 的相互作用及其激酶活性，研究人员开展体外激酶实验。Phos - tag 实验显示，添加 OsSTRK1 可增加 OsGSK2 的磷酸化水平。为排除 OsGSK2 自身磷酸化的影响，研究人员构建了 OsGSK2 的 ATP 结合位点突变体 OsGSK2 (K92E)，Y2H 实验表明该突变不影响二者相互作用，且体外磷酸化分析显示 OsSTRK1 仍能磷酸化 OsGSK2 (K92E)，且该磷酸化条带可被小牛肠碱性磷酸酶（CIP）减弱，这表明 OsSTRK1 能在体外磷酸化 OsGSK2。研究还发现，OsSTRK1 的激酶活性对于增加 OsGSK2 的磷酸化是必需的，而 OsGSK2 不会直接磷酸化 OsSTRK1。在植物体内实验中，虽然 OsSTRK1 RNAi 和过表达（OE）植株中 OsGSK2 的表达水平无显著变化，但 OsSTRK1 OE 植株中 OsGSK2 蛋白水平增加，RNAi 植株中则降低，同时 OsBZR1 蛋白水平变化趋势与之相反。Phos - tag 实验显示，OsSTRK1 OE 植株中磷酸化 OsGSK2 蛋白比例更高，RNAi 植株中更低，OsBZR1 的磷酸化比例变化趋势与 OsGSK2 一致。通过液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）分析，研究人员鉴定出 OsGSK2 上四个潜在的磷酸化位点，后续实验表明 OsSTRK1 主要在 Tyr - 223 位点磷酸化 OsGSK2。
3. OsSTRK1 通过稳定 OsGSK2 导致 OsBZR1 降解：已知磷酸酶 BSU1 可使 BIN2 去磷酸化，抑制其激酶活性并促进其降解，从而导致去磷酸化的 BZR1 积累。研究人员通过细胞无细胞降解实验发现，OsSTRK1 OE 植株中 OsGSK2 - His 的降解速率比野生型（WT）低，RNAi 植株中则更高，且该降解可被 MG132 抑制，表明 OsSTRK1 能稳定 OsGSK2 - His。对 OsBZR1 - His 的降解实验结果显示，其降解速率与 OsGSK2 - His 相反。进一步用环己酰亚胺（CHX）处理植株抑制蛋白质合成，发现 OsGSK2 在 OsSTRK1 OE 植株中更稳定，在 RNAi 植株中更不稳定，OsBZR1 的降解趋势则与之相反，且不同植株中 OsBZR1 的降解差异可被 BIKININ 消除。用 24 - 表油菜素内酯（24 - epiBL）处理植株后发现，OsSTRK1 可抑制 24 - epiBL 引起的 OsGSK2 降解。
4. OsSTRK1 在 BR 信号通路中起负向调控作用：观察 OsSTRK1 RNAi 和 OE 植株的表型发现，与 WT 相比，OsSTRK1 OE 植株的剑叶角度显著减小，谷粒更短更轻，细胞长度缩短；RNAi 植株则表现出相反的表型。对 OsSTRK1 在 24 - epiBL 处理后的表达水平进行量化，发现其 mRNA 和蛋白水平在 24 小时内下降。用 24 - epiBL 处理 WT、OsSTRK1 RNAi 和 OE 植株后，发现 OsSTRK1 OE 植株的叶片关节角度更小，胚芽鞘更短，对 24 - epiBL 敏感性降低；RNAi 植株则相反。此外，OsSTRK1 OE 植株中关键 BR 生物合成基因上调，RNAi 植株中则下调。综合这些结果表明，OsSTRK1 是 BR 信号通路的负调控因子。
5. OsGSK2 中 Tyr - 223 残基对其在 BR 信号通路中的作用至关重要：研究人员将 OsGSK2 中 Tyr - 223 分别突变为苯丙氨酸（Phe，模拟非磷酸化）和天冬氨酸（Asp，模拟磷酸化），并创建了过表达这些变体的转基因植株。结果显示，与 OsGSK2 OE 植株相比，OsGSK2 (Y223D) 过表达植株中 OsBZR1 蛋白水平更低，磷酸化水平更高；OsGSK2 (Y223F) 过表达植株中 OsBZR1 蛋白水平更高，磷酸化水平更低。表型分析发现，OsGSK2 (Y223F) 过表达植株的剑叶角度和叶片关节角度更大，OsGSK2 (Y223D) 过表达植株则更小，这表明 Tyr - 223 对于 OsGSK2 抑制 BR 信号的功能至关重要。CHX 处理实验表明，OsGSK2 - MYC 在 OsGSK2 (Y223D) 过表达植株中更稳定，在 OsGSK2 (Y223F) 过表达植株中更不稳定。在 24 - epiBL 或油菜素唑（BRZ，BR 生物合成抑制剂）处理过程中，Tyr - 223 影响了 OsGSK2 - MYC 和 OsBZR1 的蛋白水平变化。
6. OsSTRK1 抑制 OsGSK2 与 E3 泛素连接酶 OsTUD1 的结合：先前研究表明 E3 泛素连接酶 OsTUD1 与 OsGSK2 相互作用会导致 OsGSK2 降解，而本研究发现 OsSTRK1 可阻止这一降解过程。体外 pull - down 实验显示，磷酸化状态的 OsGSK2 - His 与 MBP - OsTUD1 的免疫沉淀量显著低于非磷酸化状态，且 OsSTRK1 对 OsGSK2 (K92E) 与 OsTUD1 相互作用的抑制作用不受影响，但对 OsGSK2 (K92EY223A) 或 OsGSK2 (K92EY223D) 与 OsTUD1 的相互作用无抑制作用。Tyr - 223 突变为 Asp 会减弱 OsGSK2 与 OsTUD1 的相互作用，突变为 Phe 则增强二者相互作用。体内实验结果与体外一致，表明 OsSTRK1 通过在 Tyr - 223 位点磷酸化 OsGSK2，干扰其与 OsTUD1 的结合，进而减缓 OsGSK2 的降解。
7. OsSTRK1 和 OsGSK2 在遗传上相互作用调控 BR 信号通路：已知 OsGSK2 负调控 BR 信号并影响种子大小，且本研究中 OsSTRK1 可磷酸化 OsGSK2 并负调控 BR 信号。为探究二者关系，研究人员通过基因编辑获得了 OsSTRK1 Ri11 osgsk2 - 1 和 OsSTRK1 Ri11 osgsk2 - 2 双突变植株。表型分析显示，这些双突变植株的谷粒更长，叶片角度更大，对 24 - epiBL 处理的响应与 osgsk2 突变体相似。在 OsSTRK1 Ri11 背景下过表达 OsGSK2 基因，植株谷粒更短，千粒重更轻，对 24 - epiBL 处理的敏感性降低。这些结果支持了 OsSTRK1 和 OsGSK2 在共享遗传途径中负向调节 BR 信号的假设。

讨论

GSK3 - 样激酶在真核生物中高度保守且功能多样，在哺乳动物和植物中均参与多种细胞过程的调控。在植物中，GSK3 - 样激酶是 BR 信号的关键负调控因子，其活性受到多种方式的调节。本研究揭示了 OsSTRK1 与 OsGSK2 在体外和体内均能相互作用，且 OsSTRK1 可磷酸化 OsGSK2，表明 OsGSK2 是 OsSTRK1 在水稻中的底物。OsSTRK1 通过在 Tyr - 223 位点磷酸化 OsGSK2，稳定 OsGSK2，导致 OsBZR1 降解，从而抑制 BR 信号通路。Tyr - 223 对于 OsGSK2 调节 BR 信号至关重要，它影响了 OsGSK2 与 OsTUD1 的相互作用以及蛋白稳定性。此外，OsSTRK1 在盐胁迫耐受性方面具有正向调节作用，而在 BR 信号通路中起负向调节作用，这种双重作用有助于平衡水稻的生长和胁迫响应。本研究虽然取得了重要进展，但仍存在一些局限性。例如，OsSTRK1 抑制 OsGSK2 与 OsTUD1 相互作用的具体机制尚不清楚；由于缺乏针对 OsGSK2 中 Tyr - 223 磷酸化的抗体，无法探究该位点在 BR 存在下的磷酸化水平变化；BR 导致 OsSTRK1 蛋白水平降低或抑制其活性的机制也有待进一步研究。未来研究可聚焦于探索 OsSTRK1 的上游调节因子，以及水稻中其他可能磷酸化 OsGSK2 的激酶。