利用游离型 DNA 载体工程化肾脏类器官实现促红细胞生成素递送：为慢性肾病治疗带来新希望

《Stem Cell Research & Therapy》：Erythropoietin delivery through kidney organoids engineered with an episomal DNA vector

为解决慢性肾病（CKD）患者因促红细胞生成素（EPO）产生受损导致的贫血等问题，研究人员开展了利用人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肾脏类器官恢复 EPO 产生的研究。结果显示，经 EPO S/MAR DNA 载体修饰的肾脏类器官可稳定长期递送 EPO，这为内分泌恢复治疗带来新可能。

　　在人体这个复杂的 “小宇宙” 里，肾脏扮演着极为重要的角色，它不仅负责过滤血液、排出废物，还承担着内分泌的重任。促红细胞生成素（EPO）就是肾脏分泌的一种关键激素，它能像神奇的 “指挥官” 一样，调节红细胞的生成，维持身体的正常运转。然而，当慢性肾病（CKD）来袭，肾脏的 “工作效率” 大打折扣，EPO 的产量急剧下降，贫血、骨稳态失衡等一系列健康问题也随之而来。目前，传统的治疗手段，如反复注射重组人 EPO 及其衍生物，虽然能在一定程度上缓解贫血症状，但却像一把 “双刃剑”，会带来胃肠道问题、高血压、血栓栓塞风险增加以及影响骨密度等诸多副作用。而新型的脯氨酰羟化酶抑制剂，虽然能提升 EPO 水平，却因为作用范围不局限于肾脏，容易引发不良影响。在这样的困境下，科学家们急需探索出一种更安全、有效的治疗方法，这便是这项研究的初衷。

来自荷兰伊拉斯姆斯大学医学中心（Erasmus MC）等机构的研究人员挺身而出，开启了一场探索之旅。他们将研究的目光聚焦在人诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肾脏类器官上，试图借助这些 “迷你肾脏” 的力量，恢复 EPO 的正常生产。最终，他们成功发现，经 EPO S/MAR DNA 载体修饰的肾脏类器官具备稳定长期递送 EPO 的能力，这一突破性成果为慢性肾病的内分泌恢复治疗带来了新的曙光。该研究成果发表在《Stem Cell Research & Therapy》杂志上。

为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是细胞培养技术，他们将人原代皮肤成纤维细胞诱导培养成 iPSC，并进行后续的培养与传代；其次是基因工程技术，通过设计 CAG - 绿色荧光蛋白（GFP）/hEPO - S/MAR DNA 载体转染 iPSC，构建 EPO 过表达的细胞模型；再者是类器官分化技术，诱导 iPSC 分化形成肾脏类器官；最后还运用了多种检测技术，像实时逆转录聚合酶链反应（RT - PCR）检测基因表达、免疫组化和免疫荧光染色观察细胞和组织形态、小动物微型计算机断层扫描（μCT）分析骨骼结构等，从多个角度对实验结果进行评估。

下面让我们一起来看看具体的研究结果：

1. 肾脏类器官在缺氧条件下可产生 EPO：研究人员在空气 - 液体界面培养 iPSC 衍生的肾脏类器官，惊喜地发现这些类器官包含表达足细胞标记蛋白（PODXL）的肾小球结构、表达 VILLIN 的近端小管结构以及表达 E - cadherin（ECAD）的远端小管结构，并且还含有能产生 EPO 的细胞。当把类器官置于缺氧（1% 氧气）环境中培养 4 小时后，缺氧诱导因子 2α（HIF2α）稳定下来，EPO 的释放量也从 20% 氧气条件下的检测不到，增加到了 0.20 mIU / 类器官 / 天，这充分证明了肾脏类器官具备分泌 EPO 的能力，只不过分泌量相对较低。
2. EPO⁺肾脏类器官 EPO 表达稳定升高：为了提高肾脏类器官产生 EPO 的能力，研究人员利用携带人 EPO 和 GFP 基因的 S/MAR DNA 载体对 iPSC 进行基因工程改造，获得了 EPO⁺ iPSC。在 iPSC 的 67 天扩增期内，GFP 持续稳定表达，而且 EPO⁺ iPSC 释放 EPO 的速率比对照组 iPSC 高出 4500 多倍。当这些 EPO⁺ iPSC 分化为肾脏类器官后，其 EPO mRNA 水平和 EPO 释放速率都显著高于对照组，这表明 S/MAR DNA 载体成功实现了 EPO 的过表达。
3. EPO⁺肾脏类器官可发育出肾单位结构：研究人员对 EPO⁺肾脏类器官关键肾单位标记物的 mRNA 表达进行分析，发现足细胞标记物 PODXL、近端小管标记物 VILLIN - 1 和内皮细胞标记物血小板内皮细胞黏附分子 1（PECAM - 1）的 mRNA 表达水平没有变化，但远端小管标记物 ECAD 的表达却下调了。免疫组化结果显示，EPO⁺肾脏类器官中 PODXL⁺结构增多，ECAD⁺结构减少，同时 PECAM - 1⁺内皮细胞的面积从 1.7% 增加到了 4.9%，这说明 EPO 过表达虽然对肾脏类器官的发育有一定影响，但肾单位结构依然能够正常发育。
4. EPO⁺肾脏类器官植入后血管化增强：研究人员将 EPO⁺肾脏类器官皮下植入免疫缺陷小鼠体内，4 周后发现类器官与宿主小鼠的血管系统成功连接，从宏观上就能看到皮肤血管长入类器官。对植入的类器官进行 PECAM - 1 染色，发现人和小鼠的内皮细胞距离很近，这意味着宿主血管系统和类器官内皮结构建立了联系。而且，EPO⁺类器官在植入 4 周后仍能持续高水平表达 EPO mRNA，其中的肾单位结构也得以维持，同时 PODXL 和 PECAM - 1 的 mRNA 表达增加，进一步证明了其血管化增强。
5. EPO⁺类器官可提高血细胞比容水平：研究人员给免疫缺陷小鼠分别植入不同数量的对照组或 EPO⁺肾脏类器官，4 周后发现，植入 8 个 EPO⁺肾脏类器官的小鼠耳朵出现充血现象，脾脏也增大了。全血分析结果显示，植入 EPO⁺肾脏类器官的小鼠血细胞比容水平明显升高，且与植入的类器官数量呈正相关，红细胞计数也显著增加，这充分表明肾脏类器官产生的 EPO 对宿主产生了明显的生理影响。
6. EPO⁺类器官影响小梁骨结构：由于 EPO 补充会影响骨稳态，研究人员对植入 EPO⁺肾脏类器官的小鼠骨骼进行了研究。他们发现，虽然植入 8 个对照组或 EPO⁺肾脏类器官的小鼠在骨体积分数（BV/TV%）、小梁厚度（Tb.Th）、小梁分离度（Tb.Sp）和小梁数量（Tb.N）上没有差异，但 EPO⁺类器官组的小梁骨模式因子（Tb.Pf）和结构模型指数（SMI）降低了，这意味着小梁骨空间结构更致密，骨强度可能增加。同时，EPO⁺类器官组小鼠骨髓中的成纤维细胞生长因子 23（FGF23）mRNA 表达增加，这进一步证明了 EPO⁺类器官会影响宿主的内分泌系统。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：利用 EPO S/MAR DNA 载体修饰的肾脏类器官，能够实现 EPO 的稳定长期递送。这一成果为慢性肾病患者 EPO 生成能力的恢复带来了新的希望，为内分泌恢复治疗提供了一种潜在的有效策略。不过，目前的研究也存在一定的局限性，比如肾脏类器官中 EPO 的产生是组成型的，不受细胞类型限制，可能会导致血细胞比容水平不受控制地升高，在临床应用中存在风险。因此，未来的研究需要聚焦于开发可调节 EPO 产生的肾脏类器官，并且进一步探究 EPO⁺类器官的长期影响，以及在贫血模型中的治疗效果。但无论如何，这项研究都为慢性肾病的治疗开辟了新的道路，让我们看到了再生医学在攻克这一难题上的巨大潜力，有望为广大慢性肾病患者带来新的生机与希望。