内源性蛋白 S100A14 稳定谷氨酰胺酶：肝癌索拉非尼耐药的关键机制与潜在治疗靶点

《Journal of Translational Medicine》：Endogenous protein S100A14 stabilizes glutaminase to render hepatocellular carcinoma resistant to sorafenib

为解决肝癌对索拉非尼原发性耐药机制不明的问题，研究人员开展了关于肝癌细胞对索拉非尼原发性耐药的研究。结果发现 S100A14 通过稳定谷氨酰胺酶（GLS）促进原发性耐药，抑制 S100A14 或 GLS 可增强索拉非尼疗效，这为肝癌治疗提供了新策略。

　　在肝癌的治疗领域，索拉非尼作为一种常用的靶向治疗药物，却面临着耐药的难题。许多晚期肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）患者对索拉非尼产生耐药，这使得患者的预后情况变得更差。目前，对于索拉非尼耐药机制的研究主要集中在获得性耐药方面，然而，治疗前原发性耐药的机制却依旧扑朔迷离。为了深入探究这一问题，来自复旦大学的研究人员开展了相关研究，其研究成果发表在《Journal of Translational Medicine》上。该研究为肝癌的治疗提供了新的方向和潜在的治疗靶点，意义重大。

研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞层面，进行了细胞培养，使用了多种细胞系如 Huh7、Hep3B 和 HEK293T 等。通过构建质粒、慢病毒感染等操作，对细胞进行基因编辑。利用单细胞谱系追踪结合单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术，识别原发性索拉非尼耐药细胞谱系；运用共免疫沉淀（CO-IP）和质谱分析，探寻 S100A14 的下游靶点和调控机制；借助体内小鼠异种移植实验，评估 S100A14 或其相互作用蛋白 GLS 对肝癌原发性耐药的影响。此外，还通过多种细胞实验如细胞活力、克隆形成、凋亡检测等，以及免疫组化、H&E 染色等组织实验，全面深入地研究相关机制。

研究结果如下：

1. 条形码追踪识别耐药谱系：研究人员通过给小鼠体内未接触药物的肝癌异种移植物中的单个细胞标记独特的 14 碱基对 DNA 序列（条形码），之后让肿瘤接触索拉非尼，对比药物处理前后肿瘤细胞的特征。结果发现，有 2539 个条形码在药物处理前后的肿瘤中都存在，其中 1241 个条形码（barcode high）在索拉非尼处理后富集，这些克隆被定义为耐药克隆。未接触药物的肝癌异种移植物中的 1 号细胞簇，被认为是原发性索拉非尼耐药的肿瘤细胞亚群。
2. 耐药细胞转录组特征：研究人员构建了由未接触药物的肿瘤 1 号簇中高表达的前 20 个基因组成的基因集。对癌症基因组图谱（TCGA）中的 HCC 患者进行分层分析，发现该基因集高表达与患者总体生存率显著降低相关。在这 20 个候选基因中，ANGPTL3、FXYD3、S100A4 和 S100A14 在未接触药物的肿瘤 1 号簇中高表达，推测这些基因是肝癌对索拉非尼原发性耐药的生物标志物。
3. S100A14 影响肝癌细胞对索拉非尼的敏感性：通过实验验证，S100A14 与肝癌对索拉非尼的耐药性关联最强。在 TCGA 的 HCC 患者中，S100A14 mRNA 水平在肿瘤组织中高于健康肝组织，且高表达与患者总体生存率差相关。在 Huh7 和 Hep3B 细胞系中敲低 S100A14，可使细胞对索拉非尼更敏感，表现为细胞凋亡增加、活性氧（ROS）水平升高，肿瘤细胞克隆形成能力受到抑制。
4. S100A14 稳定谷氨酰胺酶：通过无偏共免疫沉淀和 LC-MS/MS 分析，研究人员发现 S100A14 与谷氨酰胺酶（GLS）相互作用，且与肾型谷氨酰胺酶异构体（GLS_KGA）的结合更强。敲低 GLS_KGA使 Huh7 细胞对索拉非尼敏感，敲低 S100A14 缩短 GLS_KGA的半衰期，降低其蛋白水平。过表达野生型 GLS_KGA可部分挽救 S100A14 敲低导致的 ROS 和谷胱甘肽（GSH）水平变化。这表明 S100A14 通过稳定线粒体中的谷氨酰胺酶，帮助消除索拉非尼诱导的促凋亡 ROS，从而促进原发性耐药。
5. S100A14 抑制 GLS_KGA的泛素化：研究人员推测 S100A14 通过干扰 GLS_KGA的泛素化和后续的蛋白降解来稳定它。实验结果显示，敲低 S100A14 增加了 GLS_KGA的泛素化，且使 GLS_KGA活性位点残基 Y308 和 S314 的磷酸化增加。分子对接预测这些残基位于 S100A14 和 GLS_KGA复合物的界面。敲低 S100A14 后，转染磷酸化抗性突变体的 GLS_KGA泛素化水平显著降低，且突变会削弱 S100A14 与 GLS_KGA的相互作用，双突变几乎完全消除这种相互作用。这表明 S100A14 通过抑制 GLS_KGA活性位点残基 Y308 和 S314 的磷酸化来抑制其泛素化。
6. 抑制 S100A14 或 GLS 增强索拉非尼疗效：在体内实验中，敲低 S100A14 显著提高了索拉非尼对荷 Huh7 异种移植瘤裸鼠的疗效，表现为肿瘤生长受抑制、Ki67 表达降低、凋亡肿瘤细胞比例增加。使用特异性 GLS 抑制剂 CB-839 抑制谷氨酰胺酶，也增强了索拉非尼对皮下 Huh7 异种移植瘤的治疗效果，联合治疗效果更显著，且未引起明显的全身毒性。

研究结论和讨论部分指出，S100A14 可促进肝癌对索拉非尼的原发性耐药，其表达可预测晚期 HCC 患者的预后。S100A14 与 GLS_KGA结合，阻止其活性位点磷酸化，抑制泛素化，稳定 GLS_KGA，从而中和 ROS，对抗索拉非尼诱导的细胞凋亡。抑制 S100A14 或 GLS_KGA可减缓肿瘤生长，为克服肝癌索拉非尼耐药提供了新的治疗策略。然而，该研究也存在一些局限性，如未在免疫功能正常的环境中验证研究结果，未广泛验证 S100A14 介导的耐药机制在其他酪氨酸激酶抑制剂中的情况，缺乏针对 S100A14 或 GLS_KGA的特异性抑制剂等。尽管如此，这项研究为肝癌的治疗开辟了新的道路，为后续研究提供了重要的理论基础和方向，有望推动肝癌治疗领域的进一步发展。