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本文聚焦肽基赖氨酸金属内肽酶（PKMs），综述了其从传统来源生产到重组生产的发展，剖析了应用现状，如在蛋白质组学中的作用，探讨了面临的挑战，展望了未来在更多领域的应用前景，为相关研究提供全面参考。
### 肽基赖氨酸金属内肽酶（PKMs）概述
肽基赖氨酸金属内肽酶（PKMs，E.C. 3.4.24.20），也被称为 LysN 或 MEP，属于金属蛋白酶家族，能选择性切割 P1′位置赖氨酸残基的 N 端肽键。其催化活性依赖锌离子，三级结构包含五个 α 螺旋和四个 β 折叠。
PKMs 与 LysC、胰蛋白酶（Trypsin）在裂解特异性上存在差异。PKMs 针对赖氨酸 N 端，LysC 作用于赖氨酸 C 端，而 Trypsin 作用于赖氨酸和精氨酸的 C 端。此外，PKMs 对高浓度变性剂（如尿素≤8 M、盐酸胍≤1 M）有耐受性，这一特性使其在质谱（MS）分析中具有独特优势。
PKMs 的生产与纯化
传统方法中，PKMs 主要从担子菌子实体中提取，如灰树花（Grifola frondosa）、蜜环菌（Armillaria mellea）和糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）等。提取过程通常包括匀浆、沉淀（乙醇或硫酸铵）和多步层析。但该方法存在诸多问题，如子实体中 PKMs 含量低（≤3%），提取时需处理大量原料，成本较高；子实体成分复杂，增加了分离难度和 PKMs 降解风险；PKMs 含量和活性受环境、培养条件及子实体成熟度影响，导致产量和质量不稳定。
随着生物技术发展，重组蛋白工程方法用于 PKMs 生产。目前，已有来自灰树花、蜜环菌和血红栓菌（Trametes coccinea）的 PKMs 在毕赤酵母（Komagataella phaffii）中成功表达。在重组生产中，为防止细胞内非预期的蛋白水解，PKMs 常作为无活性前体（酶原）表达，激活时需切割去除抑制性前肽。
毕赤酵母表达系统常用酿酒酵母 α - 交配因子信号序列引导蛋白分泌，但该信号序列并非对所有蛋白都适用。优化信号肽、共表达伴侣蛋白等策略有助于提高 PKMs 产量和活性。不同表达宿主各有优劣，毕赤酵母在分泌、折叠和活性平衡方面表现较好；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和里氏木霉（Trichoderma reesei）适合工业规模生产，但需控制内源蛋白酶活性；大肠杆菌（E. coli）和杆状病毒表达系统因易形成包涵体，在 PKMs 生产中存在局限性。
PKMs 在蛋白质组学中的应用
在蛋白质组学领域，Shotgun 蛋白质组学是基于质谱的重要分析方法，目前蛋白质消化主要依赖 Trypsin。然而，Trypsin 的活性受 pH 影响较大，在酸性（pH <6）或碱性（pH> 9）条件下效率降低。PKMs 能在更广泛的 pH 范围（4.0 - 10.0）保持活性，且裂解特异性独特，与 Trypsin 互补。
PKMs 在蛋白质组学中的应用广泛。它能产生独特的裂解模式，与 Trypsin 和 LysC 联用可提高蛋白质序列覆盖率，增强复杂样本分析的数据可靠性。在检测赖氨酸特异性的翻译后修饰（PTMs）方面，PKMs 表现出色，能识别单甲基化和二甲基化赖氨酸残基附近的位点，而 Trypsin 的广泛裂解模式可能会遗漏这些修饰位点。
此外，PKMs 还可用于五重定量分析，提高单细胞分析的通量和稳健性。在二硫键映射实验中，酸性 pH 最佳的血红栓菌 PKMs 可避免碱性条件下的二硫键重排，减少假阳性结果。
PKMs 的未来展望
酶工程有望拓展 PKMs 在合成生物学中的应用。目前重组 PKMs 价格较高，降低成本将使其更易获取。随着新来源 PKMs 的发现和生产，其应用可能扩展到治疗和食品领域，用于产生特定功能肽。
通过蛋白质工程可优化 PKMs 的裂解特异性、稳定性和活性，设计适用于特定生化反应的变体。未来研究还可能集中于开发具有更广泛或更精确裂解能力的融合酶，实现对复杂底物（如治疗性蛋白质或药物递送系统中的合成肽）的可控消化。
