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为解决难以确定哪些基因和突变对清酒酵母特性影响最大的问题，研究人员开展了通过清酒酵母与实验室酵母杂交进行数量性状位点（QTL）分析以鉴定基因的研究。结果构建了新 QTL 分析系统，鉴定出 PBS2 基因及其突变影响乙醇和有机酸产生，该研究为清酒酵母基因研究提供了有效方法。
在微生物的奇妙世界里，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）宛如一颗璀璨的明星，活跃在各种酒精饮料的酿造舞台上。清酒酵母、烧酒 / 泡盛酵母、葡萄酒酵母等虽同属酿酒酵母，却各有独特本领，适应着不同的酿造环境。清酒酵母就像酿造清酒的神奇工匠，拥有高乙醇生产能力、耐乳酸和酸性、低温下旺盛增殖以及产生独特香气化合物等技能 。然而，长久以来，科学家们一直好奇，究竟是哪些基因和突变赋予了这些酵母在各自环境中茁壮成长的能力？尽管此前已发现一些与清酒酵母特性相关的基因，但它们是否就是影响清酒酵母关键表型的最重要因素，依旧是个未解之谜。
为了揭开这个神秘的面纱，来自日本国家酿造研究所（National Research Institute of Brewing）等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们聚焦于数量性状位点（Quantitative Trait Loci，QTL）分析系统，希望借此找到影响清酒酵母各种表型性状的关键基因，如高乙醇生产能力、香气化合物、有机酸和无机酸以及氨基酸的产生等。他们的研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》杂志上，为清酒酵母基因研究开辟了新的道路。
研究人员开展研究时，用到了几个关键技术方法。首先是杂交与单倍体分离技术，将清酒酵母单倍体菌株（Kyokai No. 7 的单倍体 K7H868a ）与实验室酵母单倍体菌株（X2180 - 1B）杂交，获得 F1 二倍体菌株后进行孢子分离，经 MAT 位点 PCR 鉴定得到 400 个 F1 分离单倍体。其次是全基因组测序与基因分型技术，对 400 个 F1 分离单倍体及其亲本菌株进行全基因组测序，通过一系列生物信息学分析，从 50,962 个单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）中筛选出 5,267 个 SNP 标记用于 QTL 分析。最后是 QTL 分析技术，分两步进行 QTL 分析，结合小试酿造实验数据确定与目标性状相关的基因位点。
下面来看具体的研究结果：
- F1 分离单倍体的获得：为提高 QTL 分析的效力和分辨率，研究人员将 QTL 分析中使用的 F1 分离单倍体数量从 100 个增加到 400 个。通过对新获得的 300 个孢子分离株进行 MAT 位点 PCR 分析，确认它们均为单倍体，成功扩充了实验样本数量。
- F1 分离单倍体的全基因组测序及 SNP 标记的提取与建立：对亲本菌株 K7H 和 X1B 进行比较基因组分析，鉴定出 50,962 个 SNP 作为 QTL 分析的 DNA 标记。考虑到 SNP 间的重组模式，最终筛选出 5,267 个间隔约 2 - 3kbp 的 SNP 标记用于改进的 QTL 分析系统，这些标记在基因组上分布较为均匀，验证了改进系统的有效性。
- 清酒酵母特征表型信息分析：对 398 个 F1 分离单倍体进行小规模清酒酿造试验，分析了总 CO2气体损失、乙醇浓度、多种有机酸和无机酸等表型数据。结果表明，清酒酵母（K7H）比实验室酵母（X1B）具有更高的乙醇生产能力，且 392 个 F1 分离单倍体的相关表型呈连续分布，受多个位点控制。
- QTL 分析（连锁分析）：与现有 QTL 分析系统相比，改进后的系统检测到了染色体 X 上超过阈值 LOD 分数的显著 QTL，整体 LOD 分数更高，分辨率也明显提升。通过对多个性状的 QTL 分析，发现染色体 X 上存在与多种性状相关的显著 QTL，为后续基因定位提供了重要线索。
- 清酒酵母高乙醇生产能力候选基因的高效筛选：基于在染色体 X 上检测到的与高乙醇生产能力相关的显著 QTL，研究人员逐步缩小候选基因范围。通过两轮 QTL 分析以及 “效应大小” 和 “氨基酸替换” 等筛选标准，将候选基因从最初的 43 个逐步缩小到 12 个，再排除 3 个仅含沉默突变的基因，最终聚焦于 PBS2 基因。
- 酿酒酵母中乙醇生产能力相关基因的鉴定：通过基因替换实验，将 12 个候选基因的清酒酵母型等位基因整合到 X1B 基因组中进行小试酿造试验。结果发现，只有 PBS2 基因被 K7H 型等位基因替换后，菌株的乙醇浓度显著降低，从而确定 PBS2 基因是影响酿酒酵母乙醇生产能力的关键基因。
- 酿酒酵母中 PBS2 基因影响乙醇生产能力的因果突变鉴定：进一步研究发现，PBS2 基因第 545 位氨基酸的替换（丝氨酸变为亮氨酸）显著影响乙醇生产能力，且 K7H 中 PBS2L545突变是隐性突变。通过构建多种突变菌株并进行小试酿造试验，验证了该突变对乙醇生产能力的影响，同时发现该突变在其他酿酒酵母和实验室酵母中罕见，仅部分 K7 菌株存在杂合突变。
- 利用 QTL 分析同时鉴定影响多种表型的基因：改进的 QTL 分析系统显示，乙醇浓度、总 CO2气体损失、有机酸和无机酸等表型在染色体 X 上存在重叠的 QTL。实验证实，PBS2 基因第 545 位氨基酸替换不仅影响乙醇生产能力，还与清酒酵母中有机酸和无机酸的产生有关，表明改进的 QTL 分析系统可同时鉴定影响多种表型的基因。
在研究结论和讨论部分，研究人员构建的改进 QTL 分析系统展现出强大的功能。它通过增加 F1 分离单倍体数量和 SNP 标记，实现了基因和突变的高效鉴定，并且通过两步 QTL 分析减少了分析时间。该系统还能估计影响目标表型的基因和突变数量，在 QTL 范围重叠时，可同时鉴定影响多种表型的共同基因和突变。此外，通过正向遗传学揭示了影响代谢变化的新调控因子，如 PBS2 基因，尽管其影响乙醇生产能力的机制尚待进一步研究，但这一发现为酿酒酵母的研究提供了新的方向。而且，该系统不仅适用于清酒酵母，还可用于鉴定影响酿酒酵母一般表型的基因和突变。这项研究成果有望解决 “什么是清酒酵母的定义特征” 这一学术问题，助力筛选目标基因和突变，开发更适合清酒酿造的酵母菌株，提升清酒品质多样性，在新育种技术、医学、预防医学和健康食品等领域具有广阔的应用前景。
