综述：蚊子对疟原虫的免疫反应限制疟疾传播

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Mosquito immune responses to Plasmodium parasites that limit malaria transmission

这篇综述聚焦于蚊子对疟原虫（Plasmodium）的免疫反应。疟原虫经蚊子传播引发疟疾，严重威胁人类健康。文中详细阐述了蚊子针对疟原虫不同发育阶段（动合子、卵囊、子孢子）的免疫机制，为理解疟疾传播和制定防控策略提供重要依据。

　　

蚊子免疫反应与疟原虫的研究背景

疟疾是一种由疟原虫（Plasmodium）引起的致命寄生虫病，全球有超过 70 种按蚊负责传播疟原虫 。尽管疟疾防控取得了进展，但每年仍有超 2 亿病例和 60 万死亡病例 。恶性疟原虫（P. falciparum）是导致大部分发病和死亡的主要病原体，尤其对撒哈拉以南非洲的儿童危害巨大。

目前控制疟疾的主要策略包括使用杀虫剂浸泡的蚊帐、室内残留喷洒、大规模使用抗疟药物、快速诊断测试后治疗，以及近期推出的部分有效的疫苗。然而，由于蚊子产生抗药性和疟原虫产生耐药性，这些方法的有效性逐渐降低，开发新的控制策略迫在眉睫。

疟原虫在蚊子体内的发育是一个复杂的过程。当雌性蚊子吸食含有疟原虫配子体的血液后，这些配子体在几分钟内转化为雌雄配子并融合形成受精卵。受精卵在大约一天内发育成能动的动合子，动合子穿过中肠上皮，只有少数能到达中肠基底膜并发育成卵囊。卵囊经过两周的孢子增殖，释放出数千个子孢子进入蚊子血淋巴，子孢子随后侵入唾液腺，当蚊子叮咬新的脊椎动物宿主时传播疟疾。

蚊子的先天免疫系统是疟原虫感染的重要屏障，它能通过黑色素化包囊、裂解或吞噬等方式消除微生物病原体 。该系统包括体液和细胞成分，由 Toll、Imd、Jak/STAT 和 JNK 等信号通路调节，补体样系统是针对细菌和疟原虫动合子阶段的重要防御效应器 。蚊子虽没有获得性免疫系统，但可以通过免疫启动反应增强对先前接触过的病原体的免疫反应。

不同疟原虫与蚊子的相容性不同，部分疟原虫菌株或物种会触发蚊子的免疫反应来消除寄生虫。研究部分相容的媒介 / 寄生虫组合，有助于揭示蚊子对寄生虫的潜在免疫反应，进而理解疟原虫的免疫逃避机制对疟疾传播的影响。

早期免疫：蚊子对动合子的免疫反应

疟原虫受精卵在蚊子中肠消化血液的恶劣环境中发育成动合子。吸血会触发蚊子肠道分泌粘蛋白和几丁质物质，形成围食膜，防止肠道微生物群与上皮细胞直接接触。疟原虫动合子分泌几丁质酶，破坏围食膜并穿过它到达上皮细胞的顶端表面。血液消化还会导致肠道微生物群大量繁殖，这些微生物群可以通过释放对寄生虫有毒的物质或激活蚊子的免疫反应间接限制寄生虫的生存。

目前对蚊子针对动合子免疫反应的工作模型主要基于对冈比亚按蚊（An. gambiae）感染伯氏疟原虫（P. berghei）的研究。在这个部分相容的模型系统中，动合子会对入侵的中肠细胞造成不可逆的损伤，最终激活蚊子的补体样系统，消除大部分寄生虫。被入侵的细胞会激活半胱天冬酶（caspase）介导的凋亡反应，诱导一氧化氮合酶（NOS）表达，以及 JNK 介导的血红素过氧化物酶 2（HPx2）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 5（NOX5）表达。这些酶会在凋亡细胞和相邻的基底膜中引发强烈的硝化反应。

围食膜的破坏会导致微生物群与中肠细胞直接接触，促使中肠细胞产生并分泌前列腺素 E₂（PGE₂）进入血淋巴。PGE₂是一种趋化因子，能吸引血细胞到基底膜。与硝化的基底膜接触的血细胞会在入侵细胞附近释放微泡，这些微泡对于激活硫酯蛋白 1（TEP1）至关重要，TEP1 是蚊子补体样系统的关键效应器。

TEP1 在功能上类似于脊椎动物的补体蛋白 C3，在血淋巴中以切割形式（TEP1^cut）与两种富含亮氨酸重复蛋白 LRIM1 和 APL1C 形成稳定复合物。TEP1^cut的激活需要从 LRIM1/APL1C 复合物中释放出来 。一种非催化丝氨酸蛋白酶 SPCLIP1 是补体样途径的关键调节因子，它能促进 TEP1 在微生物表面的积累。目前认为血细胞来源的微泡可能传递激活 TEP1 的酶或辅因子，使覆盖在动合子表面的全长未切割 TEP1（TEP1-F）转化为 TEP1^cut，从而损伤寄生虫 。相反，clip 结构域丝氨酸蛋白酶 CLIPA2 会下调 TEP1 的切割。

先前接触疟原虫感染可以通过免疫启动反应增强蚊子对后续感染的免疫反应，这种启动反应需要动合子在肠道微生物群存在的情况下入侵中肠。启动反应会导致粒细胞比例持续增加。此外，沉默 Toll 信号的抑制因子 Cactus 可以完全消除寄生虫。过度激活 Toll 信号还会使巨型粒细胞（megacytes）的比例从粒细胞的 5% 大幅增加到 80% 。巨型粒细胞与中肠相关的数量会在动合子入侵后急剧增加，并大量释放微泡，这凸显了血细胞在早期免疫反应中的重要性。

遗传选择的冈比亚按蚊抗性 L35 菌株可以通过黑色素化反应消除食蟹疟原虫（P. cynomolgi）和几乎所有测试的疟原虫物种，包括来自南美洲的恶性疟原虫 7G8。而来自非洲的恶性疟原虫菌株，如 GB4，则可以逃避蚊子的补体系统，完成发育而不被黑色素化 。通过数量性状基因座（QTL）分析、连锁群选择和功能遗传学研究，发现 Pfs47 基因编码的表面蛋白能使动合子对蚊子免疫系统 “隐形” 。破坏非洲型恶性疟原虫中的 Pfs47 会导致寄生虫被消除，而沉默 TEP1 表达可以阻止这种消除 。对比野生型和 Pfs47 基因敲除的恶性疟原虫感染蚊子的免疫反应发现，缺乏 Pfs47 表达的寄生虫会引发与伯氏疟原虫类似的免疫反应，包括 JNK 激活、动合子入侵细胞的 caspase 介导的凋亡、NOX5 和 HPx2 表达、硝化、血细胞微泡释放、TEP1 激活和动合子裂解。

Pfs47 是一个多态性基因，其单倍型在不同大陆的种群结构中有显著差异 。不同大陆的恶性疟原虫株与来自非洲（冈比亚按蚊）、亚洲（大劣按蚊 An. dirus）和中 / 南美洲（白纹按蚊 An. albimanus）的疟疾媒介同时感染实验表明，寄生虫与来自同一地理区域的蚊子更相容 。沉默 TEP1 或 LRIM1（TEP1 的稳定剂）会破坏补体样系统，阻止不相容组合感染中的寄生虫消除。将非洲 NF54 寄生虫的 Pfs47 替换为其他大陆的单倍型，会改变其与不同媒介物种的相容性 。Pfs47 结构域 2 中两个半胱氨酸之间的四个氨基酸是决定媒介相容性的主要因素。

基于这些观察，提出了 “锁和钥匙” 模型。表面具有相容 Pfs47（“钥匙”）的动合子通过与蚊子中肠的受体（“锁”）相互作用，解除蚊子的免疫反应。Pfs47 受体（P47Rec）被鉴定为蚊子上皮细胞微绒毛下区域的一种 DM9 结构域蛋白。重组 P47Rec 与重组 Pfs47 具有高亲和力结合，中肠表达 P47Rec 是寄生虫逃避蚊子免疫的必要条件。非洲型 NF54 寄生虫中的 Pfs47 通过与 P47Rec 相互作用，阻止冈比亚按蚊（G3）中入侵细胞的 caspase 介导的凋亡，P47Rec 又与热休克蛋白 Hsc70-3 结合，Hsc70-3 能防止 caspase S2 依赖的凋亡并加速入侵细胞的排出 。Pfs47 基因敲除的 NF54 动合子在冈比亚按蚊中引发的免疫反应与伯氏疟原虫非常相似，包括 caspase 激活、上皮硝化、大量血细胞微泡释放和寄生虫裂解 。研究还表明，针对 Pfs47 的 46 个氨基酸区域的抗体可以通过阻止动合子发育，显著降低蚊子感染，显示出 Pfs47 作为传播阻断疫苗靶点的潜力。

恶性疟原虫的 Pfs16 是一种寄生膜蛋白，对配子体的最佳形成至关重要，它也能降低蚊子对动合子的免疫反应。Pfs16 似乎通过下调中肠中 caspase 3/7 的活性发挥作用，针对 Pfs16 的抗体具有阻断传播的活性 。对伯氏疟原虫的诱变筛选发现 “蚊子中肠感染筛选 43”（PIMMS43）基因是免疫逃避所必需的，缺乏 PIMMS43 蛋白的动合子无法感染中肠 。然而，该基因除了免疫逃避还有其他功能，因为虽然沉默 TEP1 可以挽救动合子阶段，但卵囊中不会发育出有活力的子孢子。

沉默抑制因子 Caspar 过度激活 IMD 免疫途径，可以减少冈比亚按蚊、斯氏按蚊（An. stephensi）和白纹按蚊中的恶性疟原虫感染 。此外，在中肠或脂肪体中由血餐诱导启动子驱动表达额外拷贝蚊子 NF-κB Rel2 的免疫增强转基因斯氏按蚊品系，通过激活蚊子补体系统和增强对细菌感染的抵抗力，显著降低了恶性疟原虫感染 。黑色素化包囊可以是蚊子抗疟免疫反应的最终效应器，也可以是处理死亡动合子的一种机制。黑色素化由酚氧化酶催化，其蛋白水解激活由丝氨酸蛋白酶级联调节，包括 clip 结构域蛋白酶（CLIPs）。一些 CLIPs 是黑色素化的正调节因子（如 SCLIP1、CLIPA8、CLIPA28、CLIPB8、CLIPB4、CLIPB14、CLIPB10、CLIPB17 和 CLIPC9），而另一些是负调节因子（如 CLIPA2 和 CLIPA14） 。丝氨酸蛋白酶抑制剂 Serpin 家族成员也调节黑色素化途径，例如 serpin-2（SRPN2）抑制 CLIPB4、CLIPB10 和 CLIPB9 。此外，疟原虫动合子通过一种尚未明确的机制，将 C 型凝集素 CTL4 和 CTLMA2 募集到其表面来避免黑色素化。

晚期免疫：蚊子对卵囊和子孢子的免疫反应

蚊子对疟原虫卵囊和子孢子的晚期免疫反应相比早期对寄生虫的消除机制了解较少。到达中肠基底膜的动合子发育成卵囊，卵囊会形成胶囊，大量繁殖并生长至少 11 天。成熟的卵囊破裂会释放数千个子孢子进入蚊子血淋巴。卵囊被认为是一个 “安静” 的发育阶段，其胶囊和结合的蚊子蛋白（层粘连蛋白、溶菌酶 c-1 和基质金属蛋白酶 1）使寄生虫能够在不被蚊子免疫系统检测到的情况下发育 。然而，越来越多的证据表明存在针对卵囊的特定蚊子免疫反应。

针对发育中的卵囊，有两种不同类型的免疫反应被描述，一种是由中肠祖细胞（干细胞和肠母细胞）介导的反应 ，另一种是血细胞介导的反应 。中肠干细胞通过增殖和不对称分裂维持组织的完整性，产生一个肠母细胞来替换受损细胞和一个新的干细胞来维持干细胞池 。近期研究发现，伯氏疟原虫卵囊会触发斯氏按蚊中肠干细胞和部分分化的肠母细胞大量增殖。肠母细胞会包围卵囊并限制其生存 。活体显微镜观察显示，肠母细胞伸出丝状伪足样结构与卵囊表面接触，并在卵囊被消除时将细胞质释放到中肠腔中 。沉默 STAT 通路的抑制因子 SOCs 激活 STAT 通路，可以增加干细胞的增殖和分化为肠母细胞，降低卵囊的生存 。感染后 2 天存在的卵囊数量到感染后 8 天会减少五倍，表明约 80% 的早期卵囊被消除。当 STAT-A 被沉默时，感染后 2 到 8 天卵囊数量的减少则不会出现 。沉默 SOCs 过度激活 STAT 信号通路导致卵囊消除是由一氧化氮合酶（NOS）介导的，但 NO 如何影响肠母细胞和卵囊尚不清楚。关于卵囊消除的机制仍有许多问题，例如中肠干细胞的增殖是对邻近细胞的机械压力的反应，还是卵囊释放了某些激活干细胞的因子。当动合子到达基底膜并转化为卵囊时，它们与中肠干细胞并不共定位，这表明中肠祖细胞会增殖并向卵囊迁移，但 NO 的释放是否是引导中肠干细胞向卵囊迁移的信号仍不清楚。

转录因子 LL3 控制血细胞分化，通过 dsRNA 沉默降低其表达会增加卵囊的生存，这表明血细胞可能也会靶向疟原虫卵囊 。有趣的是，LL3 在巨型粒细胞中高度表达，巨型粒细胞释放的微泡对于补体介导的动合子消除至关重要 ，但它们对卵囊是否也有活性尚不清楚。此外，降低三种不同的酚氧化酶原（PPO2、PPO3 和 PPO9）的表达，这些在类绛色细胞中高度表达且参与黑色素化的酶，会通过一种不依赖 TEP1 的机制增加卵囊的生存，但 PPO 如何在不涉及黑色素化的情况下介导寄生虫裂解尚不清楚。

环子孢子蛋白（CS）是子孢子表面最丰富的蛋白质，也是预防疟疾感染的主要疫苗靶点。野生型伯氏疟原虫和约氏疟原虫（P. yoelii）的卵囊不会被斯氏按蚊黑色素化，但 CS 的 PEXEL 基序发生突变的寄生虫的成熟卵囊会引发强烈的黑色素化反应，显著减少到达唾液腺的子孢子数量 。寄生虫的消除是由 NOX5 介导的血细胞硝化介导的，TEP1 结合是关键的效应机制，这需要激活 Toll 信号 。只有成熟卵囊被黑色素化的观察结果表明，CS 与蚊子血淋巴和血细胞的接触是激活这种防御反应的必要条件。有趣的是，除了在动合子入侵后 NOS 和 NOX5 在上皮硝化中的作用外，突变寄生虫还激活了血细胞中的硝化，这也导致了 TEP1 介导的寄生虫消除。

此外，先感染 CS 突变寄生虫再感染野生型疟原虫的蚊子，获得了消除第二次感染的野生型寄生虫的能力，而先前感染野生型寄生虫则不会触发这种反应 ，这表明接触突变寄生虫激活了一种新的免疫启动机制。这些发现表明，野生型 CS 允许寄生虫在不被免疫识别的情况下发育，但一旦系统被突变寄生虫启动，这种机制就会失效。其他血细胞，如类绛色细胞，以及参与突变卵囊黑色素化的 PPO 的潜在参与仍不清楚。上述免疫机制是使用鼠疟原虫物种进行表征的，关于蚊子对恶性疟原虫卵囊的免疫反应以及它们是否与伯氏疟原虫引发的反应不同，知之甚少。然而，先前的研究表明，破坏冈比亚按蚊中的 STAT 信号会导致恶性疟原虫卵囊数量适度增加。

当卵囊破裂时，子孢子释放出来，与血淋巴中的体液免疫效应器和循环血细胞接触。血细胞对子孢子的吞噬作用已有报道，但并不常见 。血细胞摄取细菌比摄取子孢子更有效，这表明子孢子在向唾液腺的迁移过程中可能主动避免吞噬 。事实上，最近发现疟原虫子孢子通过谷氨酰胺环化酶（QC）介导的子孢子蛋白修饰逃避蚊子免疫系统的消除。QC 是一种酶，能催化 N 端谷氨酰胺（Gln）或谷氨酸（Glu）氨基酸残基的翻译后修饰，形成内酰胺环转化为焦谷氨酸 。在人类中，QC 已知会修饰 CD47，一种在人类癌细胞中高度表达的蛋白质，这种修饰有助于恶性细胞逃避免疫监视，使其对吞噬作用具有抗性 。通过破坏伯氏疟原虫和恶性疟原虫中的 QC 基因，探究了疟原虫 QC 对防止子孢子被循环血细胞消除的重要性。缺乏 QC 表达会导致子孢子在接触蚊子血淋巴时被黑色素化和吞噬。表达催化失活 QC 的伯氏疟原虫也会被消除，证实了 QC 的酶活性是疟原虫避免黑色素化和吞噬所必需的。此外，CS 被证明是 QC 的重要底物，QC 对 CS 的 N 端焦谷氨酸修饰是寄生虫逃避蚊子免疫的必要条件。同时沉默冈比亚按蚊中黑色素化的两个负调节因子 CLIPA14 和 CLIPA2，也会导致伯氏疟原虫和恶性疟原虫卵囊破裂时 TEP-1 介导的黑色素化显著增加，这表明这些调节因子通常会提高激活黑色素化级联反应的阈值。

结论

蚊子的上皮、体液和细胞防御反应是疟原虫感染和疟疾传播的重要屏障。蚊子对动合子的早期免疫反应对不相容的寄生虫非常有效，主要由补体样系统介导。然而，仍有一些问题有待解决，例如 TEP1 结合寄生虫表面后消除动合子的复合物的性质、TEP1^cut/LRIM1/APL1 识别病原体的机制，以及这如何导致活性 TEP1^cut从稳定复合物中释放。

针对卵囊和子孢子的晚期免疫反应似乎比消除动合子的效果要差，我们对这些机制的理解也更有限。早期和晚期免疫反应存在一些相似之处，例如动合子入侵的中肠细胞和感染 CS 表面蛋白突变<