优化乳酸奈瑟菌外膜囊泡（OMVs）分离纯化方法：迈向高效疫苗研发新征程

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Optimization of methods for isolation and purification of outer membrane vesicles (OMVs) from Neisseria lactamica

在乳酸奈瑟菌外膜囊泡（OMVs）用于疫苗研发时，传统的 OMVs 分离纯化技术存在产量低、成本高和难以规模化生产等问题。研究人员开展了优化 OMVs 分离纯化方法的研究，发现结合 300-kDa 切向流过滤（TFF）和 CaptoTM Core 400 色谱法可提高回收率和纯度，为大规模生产 OMVs 提供了有效策略。

　　在生物医学领域，外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles，OMVs）宛如一颗璀璨的新星，备受科研人员的关注。OMVs 是革兰氏阴性菌在生长过程中，尤其是在压力条件下自然释放的纳米颗粒。它由磷脂双层构成，内部包含脂多糖（LPS）、周质蛋白和膜结合蛋白等成分。这些小小的囊泡可有着大大的能量，它们在疫苗开发和药物递送等方面展现出巨大的潜力。

在疫苗开发方面，OMVs 作为抗原载体，能够激发机体产生强大且持久的免疫反应。以针对 B 群脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis serogroup B，MenB）的疫苗为例，首款基于 OMVs 的有效疫苗在古巴诞生，后续更是推动了包含 OMVs 的四组分 4 CMenB 疫苗（Bexsero?）的研发和上市，对多种 B 型脑膜炎球菌菌株提供了广泛的保护。此外，OMVs 还能作为载体，搭载异源蛋白，如将 SARS-CoV-2 重组 D614G 刺突蛋白与脑膜炎奈瑟菌的 OMVs 相连，制成的鼻内亚单位 COVID-19 疫苗，能在动物体内产生中和抗体，抵御病毒攻击。

然而，在 OMVs 大放异彩的背后，却隐藏着诸多挑战。其中，OMVs 的分离和纯化难题，就像一座难以翻越的大山，阻碍着其进一步的发展。目前，常用的分离纯化技术是超速离心（Ultracentrifugation，UC）和尺寸排阻色谱（Size Exclusion Chromatography，SEC），但它们存在不少缺点。UC 不仅耗时费力，还可能导致 OMVs 形态改变，重悬沉淀困难，产量也较低；SEC 则存在产量低、样本处理量有限的问题，这些都限制了 OMVs 的大规模生产和应用。

为了攻克这些难题，来自巴西布坦坦研究所（Instituto Butantan）和圣保罗大学（Universidade de S?o Paulo）的研究人员展开了一项极具意义的研究。他们将目光聚焦在优化乳酸奈瑟菌（Neisseria lactamica）OMVs 的分离和纯化方法上，期望找到更高效、更适合大规模生产的技术。经过一系列严谨的实验和深入的分析，研究人员发现，结合 300-kDa 切向流过滤（Tangential Flow Filtration，TFF）和 Capto^TM Core 400 色谱法，能够显著提高 OMVs 的回收率和纯度。这一研究成果为 OMVs 的大规模生产和应用带来了新的希望，在疫苗研发和生物医学领域具有重要的意义。该研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》杂志上。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。首先，他们对乳酸奈瑟菌 IAL 2606 进行培养，待其生长至稳定期后期收获菌液，通过离心和过滤获得含有 OMVs 的上清液。然后，分别采用 UC 和 TFF 对上清液进行处理，对比不同方法的产量。接着，使用 TFF 对 OMVs 进行浓缩和透析，并选用不同截留分子量的膜进行实验。之后，运用尺寸排阻色谱（SEC）、混合模式色谱（如 Capto^TM Core 400 和 Capto^TM adhere）以及膜色谱（Sartobind? Q）对 OMVs 进行纯化。最后，利用分析型尺寸排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）、动态光散射（Dynamic Light Scattering，DLS）和透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）等技术对纯化后的 OMVs 进行表征分析 。

下面来看具体的研究结果：

1. OMVs 的生产和分离：研究人员将乳酸奈瑟菌培养至稳定期后期，此时 OMVs 释放量最大。对过滤后的上清液分别采用 UC 和 TFF 处理，结果显示 TFF 的总蛋白回收率更高。例如，TFF 100-kDa 截留分子量的膜获得的样品产量最高，但可能存在低分子量杂质；TFF 300-kDa 和 500-kDa 截留分子量的膜样品中，残留 LPS 水平相当且低于 TFF 100-kDa 的样品，UC 样品的残留 LPS 水平最低。
2. SEC 纯化效果：研究人员选用 Sephacryl^TM S-200 和 Sephacryl^TM S-400 两种不同排阻尺寸的树脂对 UC 和 TFF 样品进行纯化。结果发现，只有 TFF 300-kDa 的样品色谱图与 UC 样品更为相似。在 Sephacryl^TM S-200 上纯化时，TFF 300-kDa 样品的回收率高于 Sephacryl^TM S-400。
3. 膜色谱的效果：使用 Sartobind? Q 膜色谱对 OMVs 进行纯化时，OMVs 与固定相结合紧密，难以洗脱，回收率仅为 8.7%，表明该方法在实验条件下对 OMVs 纯化效果不佳。
4. 混合模式色谱的效果：运用 Capto^TM Core 400 和 Capto^TM adhere 混合模式色谱对 TFF 300-kDa 样品进行纯化。结果显示，Capto^TM Core 400 的回收率达到 72%，Capto^TM adhere 的回收率为 59%。
5. OMVs 的表征：通过 SEC-HPLC 分析发现，TFF 300-kDa 样品经进一步纯化后效果改善；Capto^TM Core 400 和 Sephacryl^TM S-400 纯化后的样品呈现单峰，表明纯化效率较高。DLS 和 TEM 分析表明，解毒过程会使 OMVs 的水动力直径增加、多分散指数（PDI）增大；Capto^TM Core 400 纯化的样品粒径最小、PDI 最低；TEM 还证实了不同方法纯化后 OMVs 的完整性。

综合研究结果和讨论部分，这项研究具有重要意义。首先，研究人员评估了多种用于 OMVs 纯化的技术，发现 TFF 结合混合模式色谱可显著提高乳酸奈瑟菌 OMVs 的产量和纯度。其中，300-kDa 截留分子量的 TFF 膜结合 Capto^TM Core 400 色谱法在大规模应用中展现出优势，为疫苗研发和其他生物医学应用提供了更高效的 OMVs 纯化策略。其次，该研究深入分析了不同纯化方法对 OMVs 的影响，包括产量、纯度、内毒素水平、粒径分布和稳定性等方面，为进一步优化 OMVs 的生产和应用提供了理论依据。此外，研究还发现 OMVs 在解毒和纯化过程中的一些特性变化，如解毒后粒径增大、PDI 增加等，有助于深入理解 OMVs 的性质和功能。总的来说，该研究为 OMVs 在生物医学领域的广泛应用奠定了坚实基础，推动了相关领域的发展 。