《Communications Biology》：Targeting alveolar epithelial cells with lipid micelle-encapsulated necroptosis inhibitors to alleviate acute lung injury
编辑推荐：
为解决急性肺损伤（ALI）/ 急性呼吸窘迫综合征（ARDS）治疗难题，研究人员开展了关于坏死性凋亡在 ALI 中作用及靶向治疗的研究。结果发现坏死性凋亡通过 RIPK1/RIPK3/MLKL 复合物介导 ALI 进展，且开发的脂质胶束包裹药物可缓解小鼠 ALI。这为 ARDS 治疗提供新策略。
在医学领域，急性肺损伤（ALI）及其更严重的急性呼吸窘迫综合征（ARDS），就像隐藏在患者身体里的 “风暴”，是极其危险的病症。这两种疾病以气道内广泛炎症为特征，患者的气道仿佛遭受了一场猛烈的 “炎症袭击”，病死率居高不下。目前，临床治疗主要依赖保守支持疗法，如低潮气量正压通气、俯卧位通气、体外膜肺氧合和限制性液体管理等，但这些方法只能起到一定的辅助作用，无法从根本上治愈疾病。而且，针对 ARDS 的特效药物一直处于空白状态，这就像在黑暗中摸索，始终找不到那盏照亮前路的明灯。
在这种情况下，浙江大学医学院附属第二医院的研究人员挺身而出，开展了一项极具意义的研究。他们深入探究坏死性凋亡（一种受调控的细胞死亡方式，在多种炎症性疾病发病机制中起作用，但在 ARDS 中的具体特征和机制此前尚不明确）在 ALI 中的作用，并开发靶向治疗策略。最终，研究人员发现坏死性凋亡通过 RIPK1/RIPK3/MLKL 复合物的激活和形成介导 ALI 的进展，同时证实 MYD88 和 TRIF 参与了 ALI 中 TLR4 信号通路的激活。更为重要的是，他们成功开发出一种脂质胶束包裹的靶向肺泡 Ⅱ 型上皮细胞中 MLKL 的药物 GW806742X，并在小鼠实验中成功应用该药物治疗 ALI。这一研究成果意义重大，为 ARDS 的治疗提供了全新的策略和方向，仿佛在黑暗中为医生和患者点亮了一盏希望之灯。该研究成果发表在《Communications Biology》杂志上。
研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在动物实验方面，构建了 ALI 小鼠模型（通过气道滴注脂多糖（LPS）模拟临床 ARDS 早期的急性肺损伤）和盲肠结扎穿孔（CLP）模型（用于诱导多微生物败血症导致的肠穿孔和坏死）。在细胞实验中，培养了人支气管上皮细胞系（HBE）和小鼠肺泡上皮细胞系（MLE） ，并进行 LPS 刺激实验。同时，采用了 RNA 测序、蛋白质免疫印迹（Western blotting）、免疫共沉淀（co - immunoprecipitation）、实时荧光定量聚合酶链反应（qRT - PCR）等技术检测相关基因和蛋白的表达及变化。
研究结果如下：
- 转录组分析揭示急性肺损伤中坏死性凋亡途径的激活：研究人员给小鼠气道滴注 LPS 模拟急性肺损伤，然后对肺组织进行 RNA 测序、蛋白质免疫印迹和组织免疫荧光检测。RNA 测序结果显示，与坏死性凋亡相关的基因 Myd88、Trif、Ripk1、Ripk3、Mlkl、Tlr4 等均上调。通过对相关基因的全面分析，生成的热图和进行的基因富集分析（Gene Ontology enrichment analysis 和 Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）都表明坏死性凋亡途径在 ALI 小鼠肺组织中被激活。
- 急性肺损伤中坏死性凋亡的激活和表达：蛋白质免疫印迹分析发现，与对照组相比，ALI 小鼠肺组织中磷酸化的 RIPK1、RIPK3、MLKL，以及切割的 Caspase - 3 和 Caspase - 7 表达显著增加，而 Caspase - 8 表达下降。石蜡免疫荧光检测也显示，ALI 小鼠肺组织中 p - MLKL、p - RIPK1 和 p - RIPK3 的荧光强度明显增强，进一步证实了坏死性凋亡在 ALI 中的激活。但在败血症早期，坏死性凋亡未被激活。
- LPS 诱导上皮细胞中 RIPK1/RIPK3/MLKL 的磷酸化：为探究上皮细胞内是否存在坏死性凋亡，研究人员用 LPS 处理人支气管上皮细胞系 HBE。起初，CCK - 8 结果显示 HBE 细胞活性下降，蛋白质免疫印迹发现 RIPK1 和 RIPK3 磷酸化水平增加，但 MLKL 磷酸化水平变化不明显。延长 LPS 处理时间至 48 小时后，RIPK1、RIPK3 和 MLKL 的磷酸化水平均显著增加，免疫荧光染色也证实了这一结果，表明 LPS 干预的气道细胞中存在坏死性凋亡途径，但体外激活可能存在延迟。
- RIPK1 和 RIPK3 均参与 LPS 处理的上皮细胞中 MLKL 的磷酸化：MLKL 位于坏死性凋亡途径中 RIPK1 和 RIPK3 的下游。研究人员使用 RIPK1 抑制剂 Necrostatin - 1（Nec - 1）和 RIPK3 抑制剂 GSK'872 处理 HBE 细胞，结果发现 p - RIPK1、p - RIPK3 和 p - MLKL 水平显著降低，表明 RIPK1 和 RIPK3 的磷酸化对 MLKL 的激活至关重要。
- RIPK1、RIPK3 和 MLKL 在 LPS 诱导的坏死性凋亡中的相互作用：研究人员假设在坏死性凋亡过程中，p - RIPK1、p - RIPK3 和 p - MLKL 会相互结合形成复合物。通过免疫共沉淀实验证实，这三种蛋白能形成复合物，且免疫荧光染色显示它们在细胞内共定位。此外，通过蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）获取蛋白结构，利用相关网站预测复合物的三维构象，进一步支持了它们相互结合的观点。
- MYD88 和 TRIF 对坏死性凋亡激活至关重要：MYD88 和 TRIF 是 TLR4 激活后招募的不同衔接蛋白，对细胞响应 LPS 刺激起重要作用。研究人员用 siRNA 分别沉默 MYD88 和 TRIF 的表达，结果发现 p - RIPK1、p - RIPK3 和 p - MLKL 的表达下降，表明 MYD88 和 TRIF 在坏死性凋亡途径的激活中发挥作用。
- 通过 SPC 抗体修饰的脂质胶束将 GW806742X 靶向递送至肺泡 Ⅱ 型上皮细胞：肺泡 Ⅱ 型上皮细胞（AT II）在肺功能中起重要作用，研究人员制备了 SPC 抗体修饰、负载 GW806742X 的脂质纳米颗粒（SPC - M - GW） ，并对其进行表征。实验表明，SPC - M - GW 能特异性结合 AT II，有效抑制 MLKL 向细胞膜的转位，进而抑制坏死性凋亡过程。在 ALI 小鼠模型中，SPC - M - GW 显著降低了炎症因子水平，减少了肺泡灌洗液中的炎症细胞数量，改善了肺泡屏障结构，提高了小鼠的存活率，而未修饰的 GW806742X 和抗体 M - GW 效果不佳。
研究结论和讨论部分指出，在 LPS 诱导的 ALI 模型中，坏死性凋亡由 RIPK1 和 RIPK3 的激活介导，TLR4 通过 MYD88 和 TRIF 的共同作用触发坏死性凋亡。开发的脂质胶束包裹的 GW806742X 通过局部气道给药有效缓解了急性肺损伤。但研究结果仅适用于直接因素（肺因素）导致的肺损伤，不适用于败血症模型。这一研究揭示了 ARDS 新的病理机制，为其靶向治疗提供了创新策略，有望推动急性肺损伤和 ARDS 治疗领域的进一步发展，为患者带来新的希望和曙光。
