《npj Viruses》：Atomic force microscopy at the forefront: unveiling foodborne viruses with biophysical tools
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这篇综述聚焦食源性病毒，阐述其对公共健康的威胁。详细介绍原子力显微镜（AFM）等生物物理方法在研究食源性病毒中的应用，探讨其在病毒 - 宿主相互作用、传播动力学等方面的重要作用，为防控食源性病毒感染提供策略，极具科研价值。
食源性病毒：公共健康的潜在威胁
食源性病毒是引发食源性疾病的重要病原体，严重威胁全球公共健康。据世界卫生组织（WHO）数据，2010 年食源性危害在全球导致 6 亿人患病、42 万人死亡 ，食源性病毒在众多感染病例中占据显著比例。常见的食源性病毒包括诺如病毒（NoV）、甲肝病毒（HAV）、人类轮状病毒（HRV）等，它们主要通过粪 - 口途径传播，能在环境中稳定存活，且感染剂量低，极易引发疾病传播。
诺如病毒是全球病毒性胃肠炎的主要病因，在食源性病毒感染中占比极高 。由于缺乏便捷、广泛可用的诊断工具，其实际流行率可能被低估。甲肝病毒虽相对诺如病毒感染率较低，但作为肝炎的病原体，同样不可小觑。尽管已有甲肝疫苗，但目前针对甲肝仍无特效治疗方法，疫情时有发生。
从结构上看，食源性病毒多为无包膜颗粒，由核酸和蛋白质外壳（衣壳）组成 。这种结构赋予它们良好的环境稳定性，使其能在多种物理化学条件下存活，如耐冷藏、冷冻、高温和低 pH 值环境 。部分病毒，如甲肝病毒和戊肝病毒（HEV），在血液中以准包膜状态循环 ；轮状病毒则拥有三层衣壳，进一步增强了其在胃肠道环境中的生存能力 。
病毒的生命周期包括感染宿主细胞、释放基因组进行复制，以及产生新的病毒粒子感染其他细胞或宿主 。食源性病毒的致病性与病毒在环境中的稳定性以及病毒 - 宿主相互作用密切相关 。它们通常以胃肠道中的糖蛋白为受体，诺如病毒就利用宿主细胞表面的聚糖（如 HBGAs）作为细胞受体 。然而，由于缺乏有效的复制模型，诺如病毒的研究进展受到一定阻碍，其嗜性和复制周期仍有待深入探究 。
传播动力学与在食物基质中的稳定性
食源性病毒在食物中不会繁殖或产生毒素，主要通过粪 - 口途径传播 。当感染者粪便中的病毒污染食物、水或表面后，其他人接触这些污染物就可能被感染 。贝类和新鲜农产品是与食源性病毒爆发关联最密切的食物类别，它们在生产过程中易被污染，且常被生食或未经有效去污处理 。
食源性病毒具有极强的环境稳定性，能在食物相关表面存活较长时间 。例如，诺如病毒在生菜和菠菜上可保持传染性长达 2 周 ；在不同水源中，诺如病毒能存活 60 - 728 天 ，甲肝病毒和脊髓灰质炎病毒 1 型在 4℃和 23±3℃的矿泉水中可存活长达 1 年 ，戊肝病毒在水中也能稳定存在数周 。此外，大多数食源性病毒在冷冻条件下依然稳定，诺如病毒即便经过多次冻融循环或在 - 80℃储存较长时间后仍具感染性 。
然而，目前对于病毒在食物基质和环境中的稳定性了解尚存在较大差距 。这对于制定有效的病毒灭活和防控策略极为关键，不同病毒对灭活处理的耐受性差异较大，需要开发适用于不同病毒株的可靠方法。
灭活与缓解策略
为预防食源性病毒大规模爆发、提升食品安全水平，多种灭活和缓解策略应运而生 。热处理是常用的食品安全保障手段，但不同病毒对热处理的敏感性不同 。例如，简单的轻煮或蒸煮不足以灭活双壳贝类中的诺如病毒 ，而 70 - 72℃加热 2 分钟可降低诺如病毒、甲肝病毒和戊肝病毒的感染滴度 。对于戊肝病毒，71℃加热 20 分钟可完全灭活受污染肝脏中的病毒 ，但温度对病毒的灭活效果会受其所处基质的影响 。
对于新鲜产品，非热加工方法如高压处理、冷等离子体、紫外线和辐照等也可用于灭活病毒 。等离子体活化水可有效灭活蓝莓上的 MNV - 1，且在 4℃储存 45 天后仍有灭活效果 ；紫外线 - C（200 - 280nm）能损伤病毒核酸，起到灭活作用 ；辐照虽可降低病毒滴度，但难以完全灭活诺如病毒 。未来，需要进一步探索不同处理策略的协同效应，以实现最佳的水和食品安全保障。
疫苗是预防病毒感染的重要手段，甲肝病毒和轮状病毒已有相应疫苗 。但由于病毒的持续进化和基因变异，疫苗的有效性面临挑战，需要持续研究以应对这些变化，并开发针对其他食源性病毒的新疫苗。
原子力显微镜在食源性病毒研究中的应用
原子力显微镜（AFM）作为一种强大的生物物理工具，在食源性病毒研究中发挥着重要作用 。它能在生理相关条件下对样品进行高分辨率成像，以皮牛顿级别的灵敏度测量力，且无需对样品进行标记、涂层或化学固定 。
AFM 的工作原理基于通过激光束精确感知探针（由柔性悬臂和尖锐针尖组成）与样品表面的相互作用 。当探针扫描样品时，表面的起伏会导致悬臂弯曲，反射激光光斑在位置敏感光电二极管上的位置发生变化，通过 F = -k×d（k 为悬臂的弹簧常数，d 为悬臂的偏转量）的关系可将偏转量转化为作用力 。AFM - 力谱（AFM - FS）可测量针尖与样品之间的相互作用力，收集力 - 距离（FD）和力 - 时间（FT）曲线，从而获取样品的弹性、刚度和粘附性等生物物理特性 。
此外，AFM 针尖可通过功能化转化为生物传感器 。单分子力谱（SMFS）基于针尖功能化和分子间相互作用力测量，能够检测和定位特定的相互作用，如粘附和键解离 。在研究病毒感染过程中，AFM 可用于探测病毒与细胞受体的相互作用 。早期研究利用功能化的 AFM 针尖测量鼻病毒与细胞受体之间的相互作用力，为研究病毒附着机制提供了重要依据 。
在食源性病毒研究中，AFM 已被广泛应用 。它可用于成像诺如病毒样颗粒（noroVLPs）的衣壳，揭示其机械稳定性与 pH 值的关系 ；通过 AFM - 成像和纳米压痕方法可表征 noroVLPs 的机械特性，发现同一基因群中不同菌株在大小和物理稳定性上的差异 ；研究轮状病毒与受体的相互作用时，AFM 可定量和动态地描述轮状病毒与唾液酸和整合素的结合特性 ；还能通过 AFM 诱导机械疲劳，研究腺病毒粒子的逐步解聚动力学 。
AFM 还可用于评估潜在的病毒灭活策略和抗病毒治疗效果 。例如，葡萄籽提取物对 MNV 具有不可逆的杀病毒作用，AFM 实验揭示了病毒粒子的物理变化和聚集现象，证实其可使 MNV 在小鼠中失去感染性 。高速 AFM（HS - AFM）克服了 AFM 成像速率低的局限，能够捕捉病毒衣壳的组装动力学等动态过程 ，如用于研究鼠诺如病毒（MNV）与抗去污剂膜结构域的相互作用 。
除了研究病毒与宿主细胞的相互作用，AFM 在食品安全领域也有重要应用 。通过量化病毒与食品相关基质或表面的粘附力，发现病毒对聚氯乙烯（PVC）的粘附力强于玻璃，这与材料的化学特性和表面孔隙率有关 。此外，结合其他生物物理方法，AFM 可深入研究病毒在水生环境中的行为，如研究轮状病毒与天然有机物的相互作用，了解其沉积机制和聚集动力学 。
尽管 AFM 具有高分辨率和在生理相关条件下探测相互作用的优势，但也存在一些局限性 。它是一种表面扫描技术，对样品内部结构信息获取有限；样品需要固定，视野较小且垂直范围有限；探针与脆弱生物样品的相互作用可能会导致样品位移或损坏；成像和数据分析时间较长，不适用于大规模快速检测食品中的病毒污染 。不过，AFM 仍在食源性病毒的基础研究中发挥着重要作用，特别是在研究病毒 - 表面相互作用、环境持久性和灭活处理影响等方面。
AFM 与其他技术的联用
由于单一技术难以全面表征生物系统的复杂过程，AFM 常与其他显微镜技术联用 。与共聚焦显微镜和荧光显微镜联用，可在 AFM 探测的同时对活细胞进行高分辨率成像，将光学显微镜观察到的细胞结构与 AFM 形貌和粘附图相关联 。与超分辨率荧光显微镜技术（如 STED、STORM 和 PALM）联用，能进一步提升成像分辨率 。
原子力 - 电化学显微镜（AFM - SECM）结合了 AFM 和扫描电化学显微镜（SECM）的优势，可同时测量样品的形貌和电化学活性 ，用于探测病毒表面的氧化还原功能和免疫复合物的位置 。拉曼显微镜与 AFM 集成使用，可将样品的化学成分与表面特征相联系，提供生物样品的结构、机械和化学信息 。
在病毒学研究中，通过不同技术数据的互补也取得了重要进展 。例如，AFM 和质谱（MS）结合研究乙肝病毒（HBV）的生物物理特性，有助于了解其衣壳的分子组成和物理稳定性 。在食源性病毒研究中，AFM 纳米压痕实验与 MS 联用，可对 noroVLPs 的机械特性和组成提供互补信息 ；AFM 与荧光显微镜、石英晶体微天平（QCM - D）等技术结合，研究诺如病毒与潜在受体的相互作用 ，揭示了诺如病毒样颗粒与脂质域中半乳糖神经酰胺（GalCer）的特异性相互作用 。
此外，AFM 相关技术也为生物样品的纳米级表征开辟了新途径 。AFM - 红外光谱（AFM - IR）结合了 AFM 的空间分辨率和红外光谱的化学分析能力，可通过病毒的红外特征对细胞内的病毒进行成像 。表面增强拉曼光谱（SERS）与 HS - AFM 数据互补，揭示了脂质筏结构域在 MNV 内化过程中的作用，且该相互作用可能与胆固醇有关 。
生物信息学技术的发展，如分子动力学（MD）模拟，为疫苗和抗病毒治疗的开发提供了有前景的工具 。MD 模拟可预测药物靶点和配体 - 受体相互作用，减少筛选过程的工作量 。但由于病毒粒子的大小和复杂性，使用完整病毒粒子进行 MD 模拟存在一定困难 。通过基于形状的粗粒度（SBCG）MD 模拟结合 AFM 实验，可研究病毒衣壳在 AFM 纳米压痕下的变形机制 ，为研究食源性病毒的衣壳力学提供了参考方法 。另外，AFM - Assembly pipeline 等生物信息学方法旨在利用高分辨率 AFM 形貌图像和其他结构数据构建模型结构，为深入研究病毒结构和功能提供了新的思路 。
其他生物物理方法在食源性病毒研究中的应用
目前，食源性病毒传播的实际发生率尚未完全明确，可能存在低估的情况 。传统的病毒检测方法主要依赖电子显微镜（EM）和培养分离技术，而现代免疫分析方法和分子检测技术（如基于 PCR 的方法和等温扩增方法）虽已广泛应用，但仍存在诸多局限性，如缺乏合适的细胞培养模型、操作复杂、灵敏度低、便携性差以及需要专业人员和设备等 ，因此需要开发更灵敏、广泛适用且操作简便的检测方法 。
结构生物学方法，如 X 射线晶体学、电子显微镜和核磁共振（NMR），对了解病毒的外壳结构和衣壳蛋白做出了重要贡献 。尽管诺如病毒的研究受限于缺乏细胞培养系统，但小鼠诺如病毒（MNV）和诺如病毒样颗粒（noroVLPs）等模型可用于研究诺如病毒感染 。NMR 可提供分子结构和生物分子相互作用的信息，通过饱和转移差异（STD）NMR 实验等方法，研究诺如病毒样颗粒与宿主附着因子的结合，有助于阐明聚糖对诺如病毒感染的调节作用 。
质谱（MS）在结构病毒学中也是重要工具，可用于分析病毒的组成成分、结构蛋白的化学计量比和病毒组装过程 。例如，通过 MS 研究乙肝病毒和诺如病毒的组装中间体，为理解病毒的自我组装机制提供了有价值的信息 。电荷检测质谱（CD - MS）可快速、准确地分析溶液中诺如病毒样颗粒的结构，对疫苗开发和质量控制具有重要意义 。此外，MS 还可与其他蛋白质组学方法结合，鉴定调节戊肝病毒复制的宿主因子，为潜在的治疗靶点提供线索 。
表面等离子体共振（SPR）和生物层干涉术（BLI）常用于测量病毒 - 宿主相互作用的热力学性质 。SPR 基于无标记的实时生物分子结合测量，在研究病毒附着和开发病毒检测或诊断策略方面具有重要价值 。BLI 可表征结合相互作用的动力学和亲和力，用于检测诺如病毒样颗粒的特异性抗体，为临床应用提供了参考 。
单分子技术中，除 AFM 外，光镊和磁镊也是监测单个键形成和解离的重要工具 ，它们能够检测极低的力，但空间分辨率相对 AFM 较低 。
计算建模也是研究病毒动力学的重要手段 。MD 模拟不仅可与 AFM 结合研究病毒物理性质，还可作为独立技术探索病毒生物物理学 。通过 MD 模拟可筛选潜在的诺如病毒感染抑制剂，构建戊肝病毒疫苗候选物 。随着计算能力的提升和计算方法的发展，MD 模拟在病毒研究中的应用将更加广泛。
挑战与未来方向
食源性病毒对未来大流行构成重大风险，因其在各种物理环境中稳定性高，且在识别和防控策略方面存在局限 ，需要在这些领域开展更多研究，开发适用于整个食物链的新策略，并评估多种策略联合使用的效果 。
目前的挑战之一是识别和表征可能来自意外来源的新感染病原体 。新兴食源性病毒，尤其是具有潜在食源性感染途径的人畜共患病病毒，如尼帕病毒、埃博拉病毒、禽流感病毒等，需要加强监测和研究 ，以预防其在人群中的传播 。
在食源性病毒检测方面，实现高特异性、高灵敏度和可重复性的检测至关重要，但目前仍面临诸多困难，如非目标病原体的干扰、目标病毒浓度低以及采样困难等 。未来需要加强病毒与食物基质相互作用的研究，改进大规模和多重检测方法，探索非靶向检测途径 ，同时开发更合适的细胞培养系统和模型，以提高对食源性病毒感染性的评估能力 。人肠道类器官（HIE）培养系统为研究食源性病毒的感染机制提供了有价值的工具 。
在病毒灭活方面，尽管已开发多种策略，但仍需要创新技术，以在保持食品感官和营养特性的同时有效灭活病毒 。由于病毒类型多样且不断出现新菌株，对不同灭活策略的敏感性差异较大，因此需要开发针对特定病毒类型和菌株的创新控制技术，使其适用于食品行业的不同领域，并能单独或与其他技术联合使用 。
原子力显微镜（AFM）作为一种单分子工具，在研究食源性病毒方面具有独特优势，尤其在探测单个分子相互作用和揭示生物分子行为方面 。当与其他技术（如光学显微镜）联用时，AFM 的功能得到进一步增强，能够更全面地了解食源性病毒的分子结构和行为 。未来，AFM 与其他显微镜方法的联用，以及与人工智能（AI）和机器学习工具的结合，有望在防控食源性病毒感染的策略开发中发挥重要作用 。目前，AI 已用于改进 AFM 图像分析，机器学习方法与 AFM 结合可提高其性能和数据分析效率 。随着技术的发展，AI 在生物物理研究中的应用将不断扩展，为食源性病毒研究带来新的突破。
