电荷在无序蛋白与折叠结构域动态复合物中的关键作用：从分子机制到生理意义

《Nature Communications》：Role of charges in a dynamic disordered complex between an IDP and a folded domain

在蛋白质相互作用研究中，为探究多聚电解质样无序蛋白（IDP）与带电荷折叠蛋白结构域的相互作用本质，研究人员以原胸腺素 α（ProTα）和组蛋白 H1.0 的球状结构域（GD）为模型开展研究。结果发现 ProTα 在复合物中保持无序状态，且净电荷和电荷聚集影响结合亲和力。这一成果有助于理解蛋白质相互作用机制。

　　在蛋白质的微观世界里，存在着一类特殊的蛋白质 —— 无序蛋白（Intrinsically Disordered Proteins，IDP），它们没有固定的三维结构，却在细胞的各种生命活动中扮演着重要角色。蛋白质之间的相互作用是生命活动的基础，IDP 参与的蛋白质复合物形式多样，从 IDP 结合后完全折叠，到在复合物中仍保持完全无序状态。然而，目前对于多聚电解质样 IDP 与带电荷折叠蛋白结构域之间相互作用的本质，以及电荷的数量和分布在其中的作用，还缺乏系统的实验研究。为了填补这些知识空白，来自丹麦哥本哈根大学、瑞士苏黎世大学等机构的研究人员开展了一项深入的研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员选用了带负电荷且完全无序的原胸腺素 α（ProTα）和带正电荷且折叠的组蛋白 H1.0 的球状结构域（GD）作为研究模型。为了探究它们之间的相互作用，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是溶液态核磁共振光谱（NMR）技术，通过监测化学位移扰动（CSPs）、弛豫参数等，来分析蛋白质在复合物中的结构和动力学变化；二是单分子荧光共振能量转移（smFRET）光谱技术，用于量化 ProTα 与 GD 之间的结合亲和力；三是进行了全原子分子动力学模拟和粗粒度模拟，从原子层面和整体层面研究复合物的结构和动态变化。

研究结果如下：

1. ProTα 在复合物中保持无序状态：通过 NMR 实验发现，添加 GD 后，ProTα 的大部分 backbone amide 共振发生化学位移扰动，但整体峰分散度与未结合状态相似，且 NMR 峰移动路径相同，这表明 ProTα 与 GD 结合时，没有形成二级或三级结构，也没有固定的相互作用位点和相对取向。同时，ProTα 的纵向弛豫率几乎不受复合物形成的影响，横向弛豫率和异核¹⁵N - ¹H 核 Overhauser 效应（hetNOEs）在最酸性区域有适度扰动，且结合 GD 后 ProTα 的二级化学位移未受扰动，进一步证实其在复合物中保持无序。
2. ProTα 结合 GD 的带电表面但无明确结合位点：从 GD 的角度进行 NMR 滴定实验，发现 GD 的共振峰表现出快速到中间的交换，且化学位移扰动广泛分布在其一级和三级结构中，没有集中在特定区域。利用 smFRET 技术发现，ProTα 与 GD 形成的复合物在不同离子强度下表现出不同的结合行为，在 165 mM 离子强度下，主要形成 1:1 的复合物，且结合亲和力受静电作用影响显著，与 H1 相比，ProTα 与 GD 结合时释放的反离子更少。此外，不同化学计量比的复合物对 GD 的动力学影响不同，1:1 复合物中 GD 的弛豫率变化更明显，这表明 GD 与 ProTα 的相互作用没有特定的结合界面，可形成多种化学计量比的复合物。
3. ProTα 与 GD 形成动态复合物且无持久接触：全原子分子动力学模拟结果显示，该复合物高度动态，分子间残基 - 残基接触寿命短，ProTα 的回转半径波动相关时间与实验测量的链重构时间接近，进一步支持了复合物的动态特性。同时，模拟结果与实验测量的 NMR 弛豫参数和 CSPs 具有一致性，表明 GD 在模拟和实验中与 ProTα 的结合区域相同。
4. 净电荷并非亲和力的唯一决定因素：研究人员通过将 ProTα 与不同净电荷的蛋白质相互作用，发现净电荷是 ProTα 结合的重要因素，但并非唯一因素。构建不同净电荷的 GD 变体并进行 smFRET 实验，结果显示，GD 变体的净电荷越高，与 ProTα 的结合亲和力越强，但相同净电荷的变体之间亲和力也存在差异。此外，与尿素变性的 GD 相比，折叠的 GD 与 ProTα 的结合亲和力更强，这表明电荷的相对位置，即电荷聚集程度，也是影响亲和力的重要参数。
5. 电荷聚集增加亲和力：研究人员设计了另一组 GD 变体，通过交换带电侧链位置来改变电荷聚集程度。NMR 和 smFRET 实验结果表明，电荷聚集程度的变化会影响 ProTα 与 GD 的结合亲和力，一些变体增加了电荷聚集，降低了结合亲和力；而另一些变体减少了电荷聚集，亲和力则增加。粗粒度模拟结果显示，电荷聚集时，ProTα 与 GD 形成更多有利的库仑相互作用，但会导致 ProTα 构象熵的损失。

研究结论和讨论部分指出，这项研究揭示了带负电荷的 IDP 可以与带正电荷的折叠结构域表面形成微摩尔亲和力的复合物，且在复合物中保持完全无序，不形成持久接触或特定相对取向。这一发现扩展了涉及 IDP 的无序复合物的种类。研究还表明，伴侣蛋白的净电荷是亲和力的主要决定因素，电荷聚集也起着重要作用，它们的变化可以调节亲和力，进而编码高度带电蛋白质之间尚未被破译的特异性规则。此外，蛋白质修饰和局部离子浓度的变化可能会调节这类复合物的亲和力，不同的化学计量比也可能在定义带电蛋白质之间的特异性和调节中发挥作用。然而，目前还不清楚这类动态复合物在生物学中具体发挥什么作用，未来需要更多的研究来揭示它们的功能意义。总之，这项研究为理解蛋白质相互作用的机制提供了新的视角，为后续研究蛋白质复合物的功能和调控奠定了重要基础。