突破！新型黄色荧光蛋白 mGold2s和 mGold2t助力生物成像大升级

《Nature Communications》：Bright and photostable yellow fluorescent proteins for extended imaging

在生物研究中，荧光蛋白（FPs）是重要工具，但黄色荧光蛋白（YFPs）光稳定性差限制成像。研究人员利用高通量单细胞平台筛选，获得 mGold2s和 mGold2t。它们光稳定性比常用 YFPs 高 25 倍，亮度相当，拓展了生物成像的应用范围。

　　在生物研究的微观世界里，荧光蛋白（Fluorescent proteins，FPs）就像是神奇的 “照明工具”，帮助科学家们看清细胞和亚细胞结构、追踪蛋白定位、监测细胞内的各种动态变化。然而，这些 “照明工具” 却存在一个棘手的问题，许多荧光蛋白在反复或长时间光照下会迅速发生光漂白现象，就像灯光逐渐黯淡，这大大降低了信号与噪音的比例，限制了实验的时长，尤其是在超分辨率显微镜、单分子成像和电压成像等先进技术中，这个问题更为突出。而黄色荧光蛋白（Yellow fluorescent proteins，YFPs）虽然应用广泛，但光漂白速度比其他光谱类的荧光蛋白更快，严重制约了其在长时间成像和先进显微镜技术中的应用。为了解决这一难题，来自多个研究机构的科研人员展开了深入研究，其中包括贝勒医学院（Baylor College of Medicine）、北京大学等。他们致力于开发具有更高光稳定性和亮度的黄色荧光蛋白，以拓展生物成像的边界，让科学家们能够更清晰、更持久地观察细胞内的奥秘。最终，他们成功研发出 mGold2^s和 mGold2^t这两种新型黄色荧光蛋白，并将研究成果发表在《Nature Communications》上。这项研究成果意义重大，为生物研究和生物技术应用带来了新的曙光，有望推动相关领域取得更多突破。
研究人员在研究过程中主要运用了以下关键技术方法：首先，利用升级后的高通量单细胞筛选平台 SPOTlight，对大量荧光蛋白变体进行筛选；其次，通过多种显微镜技术，如宽场显微镜、全内反射荧光显微镜（TIRF）、超分辨率显微镜、单分子显微镜和激光扫描共聚焦显微镜等，对 mGold2^s和 mGold2^t进行性能测试；此外，还构建各种融合蛋白和生物传感器，以评估其在不同实验场景中的应用效果 。

研究结果

1. 升级平台筛选出高光稳定性 YFPs：研究人员优化了 SPOTlight 平台，缩短单细胞光激活时间、提高筛选通量并降低亮度测量变异性。通过随机诱变 mGold 并在酵母细胞中筛选，经过 7 轮筛选评估了 1,125,438 个细胞，最终得到 mGold2^s和 mGold2^t，二者在亮度和光稳定性上表现优异，部分突变组合对其提升显著。
2. mGold2^s和 mGold2^t的特性表征：mGold2^s和 mGold2^t的一、二光子光谱与 mGold 和 mVenus 相似。在多种光照条件下，它们的光稳定性远超 mVenus 和 mGold，如在连续宽场照明下，mGold2^s和 mGold2^t的光漂白半衰期分别可达 450 秒和 445 秒，约为 mVenus 的 20 - 25 倍 。二者在细胞内的亮度与 mVenus 和 mGold 相近，且具有单体性、低酸敏感性、快速成熟、低细胞毒性和高融合耐受性等特点，但热稳定性较 mVenus 和 mGold 有所降低。
3. 多场景成像评估：在超分辨率成像中，用结构光照明显微镜（SIM）观察 COS - 7 细胞的肌动蛋白丝和线粒体，mGold2^s和 mGold2^t光稳定性强，能捕捉更多细节和动态变化。在激光扫描共聚焦显微镜下，将其融合到 Gephyrin - FingR 用于观察抑制性突触，mGold2^s和 mGold2^t能在长时间成像中保留更多荧光。在荧光共振能量转移（FRET）应用中，将其融入基于 FRET 的环磷酸腺苷（cAMP）指示剂 YR - ICUE，可显著提高光稳定性，且部分变体响应范围与原指示剂相当。在单分子应用中，通过下拉实验和 TIRF 显微镜观察，mGold2^s和 mGold2^t的光漂白寿命更长。

研究结论与讨论

本研究成功开发出 mGold2^s和 mGold2^t，它们是目前光稳定性最强的单体黄色荧光蛋白，打破了以往增强光稳定性往往牺牲亮度的局限，实现了二者同时提升。虽然其热稳定性略有降低，但较高的分子亮度弥补了这一不足。这两种新型荧光蛋白在多种成像技术和实验场景中表现出色，为生物研究和生物技术应用提供了更强大的工具，有望成为单体黄色荧光蛋白的新 “金标准”，推动相关领域的发展。同时，研究中发现的光稳定性突变位置及机制，为进一步探究荧光蛋白光稳定性增强的分子机制提供了重要线索，后续对 mGold、mGold2^s和 mGold2^t结构的解析，将有助于更深入理解这一机制，为开发性能更优的荧光蛋白奠定基础 。