《npj Vaccines》警惕！H9N2 禽流感病毒在疫苗接种鸡群中的传播与演变：灭活疫苗的局限与新策略探索

《npj Vaccines》：Impact of inactivated vaccine on transmission and evolution of H9N2 avian influenza virus in chickens

为解决 H9N2 禽流感病毒（AIV）在鸡群中持续传播且灭活疫苗效果不佳的问题，研究人员开展了关于灭活疫苗对 H9N2 AIV 在鸡群中传播和进化影响的研究。结果发现灭活疫苗无法阻止病毒复制和传播，还促使病毒变异，而诱导细胞 / 黏膜免疫的疫苗能有效限制病毒。这为防控 H9N2 AIV 提供了新方向。该研究成果发表在《npj Vaccines》上。

　　

在全球家禽养殖领域，H9N2 禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）可谓是 “臭名昭著”。它广泛流行于至少 60 个国家的家禽群体中，在亚洲、中东以及北非地区持续传播，时不时还在美洲和欧洲 “刷存在感”。自 2016 年起，H9N2 更是成为我国家禽中占主导地位的禽流感病毒亚型，在活禽市场的分离率高达 9.4 - 23.3%。

别看 H9N2 对鸡的致病性不算强，可它带来的经济损失不容小觑，会导致家禽生产性能下降，还常常与其他病原体 “狼狈为奸”，引发混合感染。更令人担忧的是，它还有 “跨界” 的本事，能感染猪、狗、猫等多种哺乳动物，甚至人类。近年来，H9N2 感染人类的病例数急剧上升，截至 2024 年 11 月，已有超过 130 例报告，仅 2020 年后就有 84 例。而且，它还把自己的内部基因 “分享” 给多种新兴的感染人类的禽流感病毒，像 H5N6、H7N9 等，对公共卫生构成了极大威胁。

为了控制 H9N2 AIV，我国长期采用灭活疫苗免疫策略。然而，现实却给了人们一记沉重的打击。尽管自 1998 年起就大力推行接种计划，H9N2 AIV 依旧在国内鸡群中肆意传播。从接种疫苗且抗体水平高的鸡群中，经常能分离出与疫苗株抗原性差异不大的 H9N2 病毒，其他国家也频繁报告接种疫苗后效果不佳的情况。在这样的背景下，中国农业大学的研究人员挺身而出，开展了一项深入研究，旨在揭开 H9N2 AIV 在接种疫苗鸡群中持续传播的谜团，探索更有效的防控策略。该研究成果发表在《npj Vaccines》上。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。在动物实验方面，选用特定的无特定病原体（Specific - Pathogen - Free，SPF）鸡进行实验，构建病毒传播模型，模拟自然感染和疫苗接种后的情况。通过实时定量聚合酶链式反应（Real - Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，RT - qPCR）检测病毒在鸡群中的排出情况。在病毒分析技术上，采用深度测序检测病毒的单核苷酸变异（Single - Nucleotide Variants，SNVs），以此研究病毒的基因变化；利用反向遗传学技术构建重组和突变病毒，探究关键基因变化对病毒特性的影响 。

研究人员首先探究灭活疫苗对不同亚型 AIV 的作用差异。实验选用了来自 H5Ny、H7N9 和 H9N2 亚型的不同毒株制备灭活疫苗，分别免疫 SPF 鸡。结果发现，接种疫苗的鸡对 H5Ny 和 H7N9 病毒有很好的抵抗力，体内检测不到病毒。但 H9N2 病毒却截然不同，虽然在接种鸡的下呼吸道（气管、支气管和肺）中检测不到病毒，可它却能在上呼吸道（鼻甲和喉部）高效复制，平均病毒滴度达到 6.75 - 7.25 log₁₀ EID₅₀/ml 。这表明 H9N2 AIV 在上呼吸道的高效复制能力，使得接种疫苗的鸡仍会排出病毒。通过观察组织损伤和检测上呼吸道灌洗液中的免疫球蛋白 G（Immunoglobulin G，IgG）抗体水平，进一步证实了灭活疫苗无法有效保护鸡免受 H9N2 感染，上呼吸道的 IgG 抗体水平仅为血液中的 3.65%，难以抑制病毒复制。

接着，研究人员建立了疫苗诱导免疫压力下的流感传播模型，研究 H9N2 AIV 在接种疫苗鸡群中的传播和进化情况。结果显示，虽然最初 H9N2 病毒在接种疫苗鸡群中的传播速度比未接种鸡群慢，但随着传代次数增加，到第 4 代（P4）时，传播间隔明显缩短，病毒复制和传播能力迅速增强。通过对病毒基因的深度测序分析发现，接种疫苗鸡群中 H9N2 AIV 的基因多样性明显高于未接种鸡群，出现了更多氨基酸替换，不过在 P4 后基因多样性开始下降。

在研究病毒传播瓶颈时，研究人员发现接种疫苗鸡群的传播瓶颈比未接种鸡群更窄。这意味着疫苗诱导的免疫压力使得病毒在鸡群间传播时，传递的病毒多样性减少。同时，接种疫苗鸡群中缺陷干扰颗粒（Defective Interfering Particles，DIPs）的产生和传播受到限制。DIPs 通常能抑制流感病毒的复制和适应性，其在接种疫苗鸡群中的受限，可能促进了病毒的复制和传播。

进一步探究病毒变异对其复制能力的影响时，研究人员发现，虽然 H9N2 病毒在接种疫苗鸡群中传播时抗原性未发生明显改变，但部分子代病毒的复制能力却显著增强。通过对克隆菌株的研究，确定了 NP - N417D、M1 - V219I 和 NS1 - R140W 这三个关键氨基酸突变，它们能显著提高病毒的复制能力。例如，携带这些突变的重组病毒在细胞培养实验中，复制水平明显高于野生型病毒。

研究还发现，接种疫苗鸡群中产生了更多潜在的适应哺乳动物的 H9N2 AIV 毒株。对不同传代的病毒进行全基因组测序和小鼠感染实验后发现，接种疫苗鸡群来源的单克隆病毒在小鼠肺部的复制效率更高，这表明疫苗接种增加了病毒产生适应哺乳动物突变的可能性，对公共卫生构成潜在威胁。

最后，研究人员评估了能诱导细胞免疫和上呼吸道黏膜免疫的疫苗的保护效果。结果显示，H9N2 活载体疫苗（rHVT - H9）和冷适应减毒禽流感疫苗（H9N2 - LAIV）虽然诱导的体液免疫反应与灭活疫苗相当，但它们诱导的流感病毒特异性 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞反应更强，且 H9N2 - LAIV 接种鸡的上呼吸道灌洗液中 IgA 水平显著升高，鼻黏膜细胞中干扰素 - γ（Interferon - γ，IFN - γ）表达增加。这两种疫苗能有效限制 H9N2 AIV 在鸡体内的复制和传播。

综合研究结果，H9N2 AIV 在接种灭活疫苗的鸡群中不仅未得到有效控制，反而出现了病毒复制能力增强、基因多样性增加和产生更多潜在适应哺乳动物毒株的情况。而诱导细胞免疫和上呼吸道黏膜免疫的疫苗，如 rHVT - H9 和 H9N2 - LAIV，对 H9N2 AIV 感染具有更好的保护效果。这一研究揭示了灭活疫苗在防控 H9N2 AIV 方面的局限性，为修订疫苗接种策略提供了重要依据，也为开发更有效的 H9N2 AIV 疫苗指明了方向，即应注重研发能诱导细胞免疫和黏膜免疫的疫苗，这对保障家禽养殖业的健康发展和公共卫生安全意义重大。