优化与预测 Cre 重组酶：开启小鼠精准基因组编辑新篇章

《Genome Biology》：Systematic optimization and prediction of cre recombinase for precise genome editing in mice

为解决 Cre-Lox 系统在小鼠基因编辑中存在的成本高、时间长、重组不可预测等问题，研究人员开展了对 Cre 介导重组的系统分析研究。结果发现多种因素影响重组效率，如 loxP距离等。该研究为优化 Cre 介导重组提供框架，提高实验精度，降低成本。

　　在生命科学研究的广袤领域中，小鼠作为重要的模式生物，其基因编辑技术对于揭示基因功能、模拟人类疾病等方面至关重要。其中，Cre-Lox 系统堪称基因编辑的 “魔法剪刀”，自 20 世纪 80 年代问世以来，广泛应用于小鼠基因编辑，可实现基因的靶向删除、易位、倒位等操作，还能用于构建条件性基因敲除小鼠模型，在神经科学、癌症研究等多个领域发挥关键作用，推动了生命科学的发展。然而，这把 “魔法剪刀” 并不完美。使用该系统成本高昂，构建条件性等位基因约需 16000 - 18000 美元，耗时长达 7 - 9 个月；重组效率也不尽人意，存在不可预测性，比如在目标组织中会出现重组嵌合现象，导致实验结果出现偏差。此外，虽然已有研究表明 Cre 驱动菌株、lox_P位点间距离等因素可能影响重组效率，但缺乏系统性研究，不同因素在不同遗传背景下的作用机制尚不明确。
为了解开这些谜团，美国杰克逊实验室（The Jackson Laboratory for Mammalian Genetics）等机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Genome Biology》杂志上，为优化 Cre-Lox 系统在小鼠基因编辑中的应用提供了重要依据。
研究人员采用了多种关键技术方法。首先，利用 Bxb1 重组酶系统，将含有不同 lox_P位点间距离的构建体整合到小鼠基因组的特定位置，成功创建了多个携带条件性等位基因的小鼠品系。其次，通过交配实验，将不同的 Cre 驱动菌株与携带条件性等位基因的小鼠杂交，获得 F1 代 offspring，运用 PCR 和探针检测等技术对其进行基因分型，分析重组效率和嵌合情况。此外，还对小鼠的组织样本进行处理，利用荧光显微镜观察特定基因的表达情况，从细胞层面研究重组效果。
研究结果如下：

1. Cre 驱动菌株和 lox_P间距离对重组和嵌合的影响：研究人员以 R26 位点为研究对象，评估了 Ella-cre、CMV-cre 和 Sox2-cre 三种常用 Cre 驱动菌株在不同 lox_P间距离下的重组效率和嵌合情况。发现 Sox2-cre 在 lox_P间距离不超过 10kb 时重组效率较高，且随着 lox_P间距离增加，三种 Cre 驱动菌株的重组效率均下降。例如，在 lox_P间距离为 0.8kb 时，Sox2-cre 与 R26-0.8kb flox 组合的后代中，79% 表现出重组；而当距离增加到 15kb 时，Sox2-cre 与 R26-15kb flox 组合的后代均未发生重组。这表明研究人员在设计实验时，若期望实现完全重组，应将 lox_P间距离设计为小于 4kb；若想获得嵌合重组，可将距离设定为大于 8 - 10kb。
2. 突变 lox_P位点时的最佳重组距离：通过构建含有不同突变 lox_P位点间距离的双 loxed 倒向开放阅读框（DIO）小鼠品系，研究发现使用突变 lox_P位点时，lox_P间距离小于 3kb 时重组效率较高。如 Sox2-cre 与 R26-DIO-1.1kb 组合的后代中，81% 表现出重组；随着距离增加到 8.1kb，重组效率降至 18%。因此，研究人员建议在设计 DIO floxed 等位基因时，为提高重组效率，lox_P间距离应小于 3kb；若希望获得更多嵌合个体，可将距离设为约 8kb。
3. 野生型与突变型 lox_P位点的比较：研究人员构建了携带不同 lox_P位点（野生型或突变型 lox71/66）且 lox_P间距离固定为 6.9kb 的小鼠品系，发现使用野生型 lox_P位点可显著提高重组效率。例如，在与 Sox2-cre 杂交时，携带野生型 lox_P位点的小鼠重组效率从 0% 提升至 42%。同时，通过对 Rhbdf1 基因的研究发现，当突变 lox_P位点间距离从 6.9kb 缩短至 2.9kb 时，重组效率明显提高，这表明对于高效的 Cre 重组，突变 lox_P位点间的最佳距离小于 3kb。
4. 合子型对重组效率的影响：研究人员通过一系列杂交实验，发现杂合型 floxed 等位基因的小鼠在与 Cre 驱动菌株杂交时，重组效率高于纯合型。例如，在 Ella-cre 与 R26-2.25kb 的杂交实验中，杂合后代的重组率为 38%，而纯合后代仅为 14%。这表明在实验设计中，选择杂合型 floxed 等位基因可能更有利于提高重组效率。
5. 繁殖者年龄对重组效率的影响：研究人员使用不同年龄的 CMV-cre 和 Sox2-cre 雌性小鼠与携带不同 floxed 等位基因的雄性小鼠杂交，发现繁殖者年龄对重组效率有显著影响。一般来说，过年轻（小于 10 周龄）或过老（大于 25 周龄）的繁殖者，其后代的重组效率较低，最佳繁殖者年龄在 8 - 20 周龄左右。
6. 不同基因组位点的重组效率：研究人员利用 Sox2-cre 与 12 种不同的条件性基因敲除小鼠品系杂交，这些品系的 floxed 等位基因位于小鼠基因组的不同区域，且 lox_P间距离均小于 4kb。结果发现，无论染色体位置如何，重组效率都较高，表明条件性基因敲除等位基因在 lox_P间距离小于 4kb 时，在不同基因组位置都能实现高效重组。

研究结论和讨论部分指出，本研究系统地优化了小鼠中 Cre 介导的重组过程，明确了多种因素对重组效率的影响，为设计携带野生型和突变型 lox_P位点的 floxed 等位基因提供了指导原则。研究发现 Sox2-cre 在重组过程中表现优异，使用野生型 lox_P位点时，最佳 lox_P间距离小于 4kb；使用突变型 lox_P位点时，最佳距离小于 3kb。此外，研究还表明，只要 lox_P间距离小于 4kb，在不同基因组位置都能实现高效重组。这些发现加深了人们对 Cre 介导重组的理解，为未来的基因编辑实验提供了坚实的理论基础。同时，研究成果还有助于构建更好的小鼠疾病模型，例如在癌症研究中，通过控制重组效率和嵌合情况，模拟人类癌症的发生发展过程，为癌症治疗提供新的思路和方法。总之，该研究对于推动生命科学和健康医学领域的发展具有重要意义。