《Biology Direct》：Large-scale bulk and single-cell RNA sequencing combined with machine learning reveals glioblastoma-associated neutrophil heterogeneity and establishes a VEGFA+ neutrophil prognostic model
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为探究中性粒细胞在胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤微环境（TME）中的功能及异质性，研究人员开展了 GBM 相关中性粒细胞（GBMAN）亚群的研究。他们整合分析大量单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）数据，构建 “VEGFA+中性粒细胞相关特征”（VNRS）模型。该模型可精准预测患者预后，为 GBM 治疗提供新方向。
在人体这个复杂的 “小宇宙” 里，肿瘤的存在就像一颗不安分的 “小行星”，不断打破身体的平衡。胶质母细胞瘤（GBM）作为一种极具侵袭性的脑部肿瘤，其肿瘤微环境（TME）更是如同一个神秘且危险的 “星际空间”，各种细胞和分子在这里相互交织、相互影响。中性粒细胞，作为人体免疫系统的 “先锋部队”，在 GBM 的 TME 中却一直被忽视，其功能和特性犹如隐藏在迷雾之中。尽管它们在人体循环系统中数量众多，是抵御微生物感染的 “第一道防线”，但在 GBM 研究领域，相较于巨噬细胞等 “明星细胞”，中性粒细胞的研究少之又少。这主要是因为中性粒细胞 “寿命短暂”，且缺乏增殖能力，研究起来困难重重，导致其在 GBM 中的作用被严重低估。然而，随着研究的深入，中性粒细胞在胶质瘤生物学中的重要性逐渐显现，它们与肿瘤细胞相互作用，参与肿瘤的发生、发展和免疫调节等多个过程。但 GBM 中特定中性粒细胞亚群的精确功能和分子基础仍不清楚，这就像在黑暗中摸索，急需一盏明灯照亮前行的道路。
为了揭开 GBM 中中性粒细胞的神秘面纱，南方医科大学的研究人员勇挑重担，开展了一项极具意义的研究。他们整合分析了来自 9 个数据集、127 个样本的大规模单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）数据，全面深入地研究 GBM 相关中性粒细胞（GBMAN）的亚群特征、发育轨迹、细胞通讯以及转录调控网络。在此基础上，研究人员利用机器学习技术，构建了一种名为 “VEGFA+中性粒细胞相关特征”（VNRS）的风险预测模型。研究结果发表在《Biology Direct》上，为 GBM 的研究和治疗开辟了新的方向。
研究人员在研究过程中，主要运用了以下几种关键技术方法：首先是数据获取，从公共数据库收集了大量的 scRNA - seq 数据、批量 RNA 测序（bulk RNA - seq）数据和微阵列数据。接着，对 scRNA - seq 数据进行处理和整合，统一参考基因组，过滤低质量细胞，进行批次效应校正等。然后，通过多种算法进行细胞注释、评估亚群纯度、分析发育轨迹、细胞通讯和基因调控网络等。最后，运用多种机器学习算法构建并评估 VNRS 模型。
研究人员通过对 127 个 IDH 野生型 GBM 样本的 scRNA - seq 数据进行整合分析，共处理和整合了 498,747 个单细胞转录组。经过严格的质量控制和分析流程，成功鉴定出 5,032 个中性粒细胞，并将其分为 MNDA+GBMAN、LGALS1+GBMAN、ADM+GBMAN 和 VEGFA+GBMAN 四种不同亚型。通过 ROGUE 指数评估，发现这四种亚型的纯度都很高。进一步分析发现，MNDA+GBMAN 和 LGALS1+GBMAN 特征相似，ADM+GBMAN 和 VEGFA+GBMAN 特征相似，且在复发性患者中，MNDA+GBMAN 比例下降，VEGFA+GBMAN 比例上升。
为了探究 GBMAN 的发育轨迹，研究人员利用扩散图和相关算法进行分析。结果显示，中性粒细胞逐渐从 MNDA+GBMAN 向 VEGFA+GBMAN 发育，ADM+GBMAN 也具有显著的分化潜力。在这个过程中，中性粒细胞的功能发生了动态变化，从最初参与防御和免疫反应，逐渐转变为具有明显的缺氧特征，且在分化过程中，其干扰素 - γ 和炎症反应先上升后下降，最终转变为免疫抑制性的 VEGFA+GBMAN。
在细胞通讯方面，研究人员利用免疫因子反应数据和 CellChat 等工具进行分析。发现不同细胞因子刺激不同 GBMAN 亚型的形成，且各亚型与基质细胞、肿瘤细胞和巨噬细胞等都有较强的相互作用。在从 MNDA+GBMAN 向 VEGFA+GBMAN 分化过程中，多个受体 - 配体轴的作用发生变化，影响肿瘤细胞和基质细胞的功能，促进肿瘤的生长和免疫逃逸。
研究人员还对 GBMAN 亚型的基因调控网络进行了分析。发现从 MNDA+GBMAN 到 VEGFA+GBMAN，基因组不稳定性逐渐降低，且不同亚型在原发性和复发性样本中具有不同的关键转录因子（TFs）。通过基因集富集分析（GSEA），揭示了不同亚型在原发性和复发性阶段的基因调控网络差异，各亚型的基因调控网络主导着独特的功能。
基于 VEGFA+GBMAN 的免疫抑制特征，研究人员构建了 VNRS 模型。通过对多个队列的分析，发现该模型具有较高的预测准确性和稳定性，在预测患者总体生存（OS）方面表现优异，且优于其他已发表的胶质瘤预测模型。
研究人员进一步评估了 VNRS 模型在预测肿瘤免疫浸润和免疫检查点治疗疗效方面的能力。发现高 VNRS 风险评分的 GBM 患者肿瘤免疫细胞浸润程度更高，且免疫检查点分子表达上调，提示对免疫检查点抑制剂（ICI）治疗可能更敏感。同时，通过分析不同风险组的细胞相互作用和代谢模式，发现高风险组中中性粒细胞与不良预后相关，且代谢途径发生改变，影响肿瘤的生长、侵袭和耐药性。对药物敏感性的分析表明，一些药物在高风险组中敏感性增强，具有潜在的治疗价值。
研究人员还对 VNRS 模型基因的表达进行了验证，发现在肿瘤样本和正常样本中，相关基因的 RNA 和蛋白质表达存在差异，进一步支持了模型的可靠性。
综上所述，该研究利用大规模 scRNA - seq 技术，深入剖析了 GBMAN 的异质性，明确了其发育轨迹、细胞通讯和基因调控网络。构建的 VNRS 模型为 GBM 患者的预后评估和治疗决策提供了有力的工具，具有重要的临床意义。同时，研究也揭示了中性粒细胞在 GBM TME 中的关键作用，为 GBM 的免疫治疗开辟了新的思路。然而，研究也存在一定的局限性，如仅依赖 RNA 表达数据，难以评估遗传变异和转录后调控机制；TME 的异质性也给研究带来了挑战。未来需要整合多组学方法，进一步完善模型，提高预测准确性，为 GBM 患者带来更多的希望。
