《Microbial Cell Factories》：Expression and characterization of cold-adapted xylanase Xyl-L in Pichia pastoris for xylooligosaccharide (XOS) preparation
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为解决木聚糖酶在工业生产中的应用问题，研究人员开展了在毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达冷适应木聚糖酶 Xyl-L 并评估其生产低聚木糖（XOS）潜力的研究。结果表明，Xyl-L 可成功表达并降解多种面粉底物产生 XOS，这为其在食品和营养行业应用提供了可能。
在植物生物质的世界里，木聚糖是仅次于纤维素的第二大丰富多糖，它就像植物细胞壁的坚固 “骨架”。木聚糖酶作为能将木聚糖水解成低聚木糖（XOS）的 “神奇剪刀”，在工业领域有着广泛的应用。在动物饲料中，它能帮助动物更好地消化，减少排泄物中的矿物质残留；在烘焙行业，能改善面团的特性；在果汁生产和造纸工业中，也发挥着重要作用。而 XOS 因其对人类和动物的益生元效应，如降低胆固醇、促进钙吸收、抗氧化等，受到越来越多的关注。
目前，木聚糖酶的生产和应用面临一些挑战。一方面，不同来源的木聚糖酶在活性和稳定性上存在差异，如何选择合适的酶源是关键问题。另一方面，生产木聚糖酶的宿主生物也会影响最终产品的质量和安全性。
为了解决这些问题，来自智利大学（University of Chile）的 Sebastián Rodríguez 等人开展了相关研究。研究人员将来自南极的冷适应 GH10 木聚糖酶 Xyl-L 在毕赤酵母中进行表达，并评估其生产 XOS 的潜力，研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上。
研究人员用到的主要关键技术方法包括：基因合成与克隆技术，将编码 Xyl-L 的基因进行密码子优化并克隆到毕赤酵母表达载体；发酵培养技术，通过小规模筛选培养和 3L 生物反应器的分批补料培养获得重组 Xyl-L；蛋白纯化技术，对发酵液中的 Xyl-L 进行纯化；酶活性测定和产物分析技术，利用 DNS 法测定酶活性，采用 HPLC 分析水解产物。
研究结果如下：
- Xyl-L 菌株比较：通过比较 AOX1（PAOX1?）和 GAP（PGAP?）启动子驱动的重组 Xyl-L 在毕赤酵母中的表达，发现PAOX1?启动子在甲醇诱导的筛选培养中，每湿细胞重量的活性更高。同时，将编码有助于蛋白质折叠的基因（HAC1 或 PDI1）与P40X+Xyl菌株共转化，并未提高 Xyl-L 的催化活性。
- 分批补料生物反应器 Xyl-L 生产：选择PAOX1?XyL?亲本菌株在生物反应器中进行分批补料培养。结果显示，木聚糖酶活性在甲醇诱导 27 小时后开始出现，并在培养结束前达到峰值。
- Xyl-L 的表征：对纯化后的 Xyl-L 进行表征，其比活性为 5.10 ± 0.21 U/mg，Km?值为 3.5mg/mL，kcat?为 9.16 s?1 。该酶在 pH 5.6 - 8.6 和 37 - 44°C 范围内，相对活性保持在 80% 以上，且能被CaCl2?和MgCl2?激活，被MnCl2?抑制。
- 不同面粉和山毛榉木聚糖作为底物的水解产物分析：以不同面粉和山毛榉木聚糖为底物进行酶促反应，发现 Xyl-L 能降解这些底物产生不同聚合度（DP）的 XOS。其中，全麦面粉、黑麦面粉、燕麦面粉和通用面粉都能产生 DP 为 2 的 XOS，全麦面粉还能产生 DP 为 3 的 XOS，山毛榉木聚糖则能产生 DP 为 2、3 和 4 的 XOS。
研究结论和讨论部分指出，冷适应木聚糖酶 Xyl-L 在毕赤酵母中成功表达并分泌，PAOX1?启动子的甲醇诱导表达策略优于组成型PGAP?。虽然添加有助于蛋白表达的基因未能提高 Xyl-L 的产量，但该酶在毕赤酵母表达后的糖基化可能影响其分子量和热稳定性。Xyl-L 的动力学参数、pH 和温度适应性使其适合大多数工业应用。此外，Xyl-L 能够降解食品工业中的复杂面粉底物产生 XOS，这为其在食品和营养行业的应用提供了潜力。不过，要实现其在工业上的大规模应用，还需要进一步优化生物工艺，提高产量和酶的比活性。总之，这项研究为木聚糖酶在食品和营养行业的应用开辟了新的道路，具有重要的理论和实践意义。
