基于蜕皮壳光谱分析的基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）在节肢动物鉴定中的应用研究

《Biological Procedures Online》：Assessment of MALDI-TOF MS for Arthropod Identification Based on Exuviae Spectra Analysis

目前节肢动物鉴定存在难题，传统形态学方法耗时且依赖专家，分子方法成本高、耗时长。为解决这些问题，研究人员开展基于节肢动物蜕皮壳的 MALDI-TOF MS 生物分型研究。结果显示该技术鉴定效率高，能克服传统方法局限，为节肢动物研究提供新途径。

　　在奇妙的生物世界里，节肢动物可是个大家族，它们种类繁多、数量庞大，约占动物物种总数的 79%。其中一些节肢动物可不得了，像蚊子、蜱虫等，它们不仅会吸食血液，还担当着传播病原体的 “坏角色”，引发各种人类和动物疾病，给健康带来极大威胁。所以，准确识别这些节肢动物，把传播疾病的 “坏家伙” 和其他区分开来，就成了防控疾病的关键第一步。

一直以来，人们常用形态学方法来鉴别节肢动物，就是通过观察它们的外形特征来判断种类。但这方法问题不少，不仅花费时间长，还特别依赖那些经验丰富的昆虫学家，而且一旦节肢动物的身体有损伤，鉴别起来就更困难了。后来，分子鉴定方法出现了，它虽然精准可靠，不受发育阶段的影响，可也有自己的 “短板”，比如获取结果耗时久，试剂成本还特别高，这就限制了它的广泛应用。

有没有更好的办法呢？来自艾克斯 - 马赛大学（Aix Marseille Univ）等机构的研究人员决定一探究竟。他们开展了一项关于利用 MALDI-TOF MS 技术，基于节肢动物蜕皮壳光谱分析进行物种鉴定的研究。研究结果令人惊喜，MALDI-TOF MS 技术在鉴定节肢动物方面表现出色，能克服传统形态学和分子鉴定方法的诸多局限。这一成果发表在《Biological Procedures Online》上，为节肢动物的研究、疾病防控和害虫治理开辟了新的道路。

研究人员为了开展这项研究，用到了几个关键技术方法。首先是 DNA 提取和定量分析，从不同节肢动物的蜕皮壳和新鲜标本中提取 DNA 并进行定量；其次是 PCR 扩增，针对不同节肢动物家族，使用特定引物对线粒体细胞色素氧化酶亚基 I（COI）、核糖体 16 - 18S 亚基序列进行扩增；然后是 MALDI-TOF MS 分析，对样品进行处理后获取蛋白质质谱，并进行数据库比对分析 。

下面来看看具体的研究结果：

• 节肢动物蜕皮壳的收集：研究中涉及的节肢动物蜕皮壳均来自实验室养殖的种群。由于缺乏针对蜕皮壳的分类检索表，无法通过形态学分析验证其身份。不同节肢动物蜕皮壳大小差异明显，蚊子、臭虫和虱子的蜕皮壳比锥蝽和蟑螂的小很多。为防止 DNA 和蛋白质降解，收集后迅速冷冻保存。
• 节肢动物蜕皮壳的分子生物学分析：从 9 种节肢动物的蜕皮壳（每种 12 个）和新鲜标本（每种 5 个）中提取 DNA。结果发现，新鲜标本提取的 DNA 量显著高于蜕皮壳。在分子鉴定中，新鲜样本的 PCR 扩增成功率为 100%，而蜕皮壳样本仅 50%。测序成功的蜕皮壳样本更少，仅占 10.2%，这表明基于蜕皮壳的分子鉴定存在较大困难。
• MALDI-TOF MS 分析：
  • 样本制备条件优化：根据节肢动物家族不同，采用不同策略分析蜕皮壳。对蚊子、臭虫和虱子，分析整个蜕皮壳；对锥蝽和蟑螂，则分别分析腿部和胸部加头部的蜕皮壳，最终选定腿部进行后续分析，并确定了最佳的样本处理参数。
  • MS 光谱的重现性和特异性评估：对 342 个蜕皮壳样本进行 MALDI-TOF MS 分析，89.8% 的样本获得了高强度的 MS 光谱。通过多种分析方法证实，MS 光谱在种内具有重现性，种间具有特异性，同一科的物种光谱在聚类分析中也聚集在一起。
  • 基于蜕皮壳 MS 光谱的节肢动物物种鉴定评估：创建参考数据库后，对除数据库样本外的 MS 光谱进行查询，289 个光谱全部正确鉴定，且 85.8% 的样本 log 评分值（LSV）大于 1.8，表明鉴定可靠。不过，仍有部分样本的 LSV 未达到阈值。
  • 同一物种不同身体部位蜕皮壳 MS 光谱的相似性：对于大型蜕皮壳的物种，研究发现腿部和胸部加头部的蜕皮壳 MS 光谱虽有差异，但也有许多共享峰，即使使用仅含腿部光谱的数据库查询胸部加头部光谱，仍能正确鉴定所有物种，不过部分胸部加头部光谱的 LSV 未达阈值。
  
  

研究结论和讨论部分再次强调了该研究的重要意义。MALDI-TOF MS 生物分型技术可用于多种节肢动物家族的鉴定，基于蜕皮壳的分析具有种内重现性和种间特异性，能实现准确鉴定。这一技术克服了传统形态学鉴定因缺乏鉴定关键而难以实施，以及分子生物学因蜕皮壳 DNA 量低而面临的局限。然而，研究也指出，未来还需对野外收集的蜕皮壳进行评估，考虑蛋白质降解对 MS 谱的影响，以进一步验证该技术的可靠性。总之，这项研究为昆虫学研究、节肢动物疾病媒介监测和害虫管理提供了创新且有前景的方法。