通过磷脂酰胆碱合成调控揭示裂殖壶菌中磷脂与二十二碳六烯酸代谢关联机制

《Microbial Cell Factories》：Determining metabolic mechanism linking phospholipids and docosahexaenoic acid through phosphatidylcholine synthesis by phosphocholine cytidylyltransferase (CCT) overexpression in Schizochytrium sp

为探究磷脂酰胆碱（PC）生物合成调控对脂质和二十二碳六烯酸（DHA）产生的影响，研究人员开展了过表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶（CCT）基因的研究。结果显示，CCT 过表达促进总脂质合成和 DHA 积累。该研究有助于阐释磷脂代谢与 DHA 产生的关联机制。

　　在神奇的微生物世界里，有一种名为裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）的微生物备受关注。它就像一个小小的 “宝藏工厂”，能合成多种对人体有益的活性物质，其中二十二碳六烯酸（DHA）尤为突出。DHA 作为一种重要的多不饱和脂肪酸（PUFA），在人体的生长发育、大脑功能维持等方面发挥着关键作用，比如对婴幼儿的大脑和视力发育至关重要。

然而，目前关于裂殖壶菌合成 DHA 的具体机制，科研人员还没有完全弄清楚。尤其是磷脂代谢与 DHA 积累之间的关系，存在许多未知。磷脂是细胞膜的重要组成部分，在细胞的物质运输、信号传递等过程中扮演着关键角色，它与 DHA 的合成和积累究竟有着怎样千丝万缕的联系呢？这成为了亟待解决的科学问题。

为了揭开这个谜团，厦门大学的研究人员展开了深入研究。他们将目光聚焦在磷酸胆碱胞苷酰转移酶（CCT）上，CCT 是参与 PC 合成的关键酶，而 PC 又在 DHA 的迁移和积累过程中起着重要作用。研究人员推测，通过调控 CCT 的表达，或许能够找到解开磷脂代谢与 DHA 积累关系的钥匙。

经过一系列严谨的实验，研究人员发现，过表达 CCT 虽然对细胞生长有轻微抑制，但却显著促进了总脂质的合成。与野生型菌株相比，过表达 CCT 的菌株（SR21-CCT）中 PUFA 含量和 DHA 产量分别增加了约 49% 和 46%。这一结果令人振奋，表明 CCT 在脂质代谢和 DHA 积累过程中有着重要的调控作用。

进一步研究发现，CCT 过表达增强了磷脂的合成，特别是强化了甘油磷酸胆碱酰化和 PC 从头合成途径。这使得更多的 DHA 酯化到 PC 中，进而促进了 DHA 在三酰甘油（TAG）中的积累。此外，研究还发现，CCT 过表达影响了脂质代谢途径中关键基因的转录水平，如脂肪酸合酶（FAS）基因的转录水平下降，而链长因子（CLF）基因的转录水平上升，这导致饱和脂肪酸（SFA）比例下降，PUFA 比例上升，进一步促进了 DHA 的合成。

这项研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上，具有重要的意义。它不仅为揭示磷脂代谢与 DHA 积累之间的关联机制提供了新的视角，也为通过调控磷脂代谢来提高 DHA 产量提供了理论依据，为微生物发酵生产 DHA 的工业化应用奠定了更坚实的基础。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是基因工程技术，通过构建含有 CCT 基因的重组质粒，并将其导入裂殖壶菌 SR21 中，实现 CCT 基因的过表达；其次利用了脂质分析技术，包括脂质提取、固相萃取（SPE）、薄层层析（TLC）和气相色谱（GC）分析，用于测定脂质含量和脂肪酸组成；此外，还运用了定量实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术，来分析脂质代谢途径中关键基因的转录水平变化。

研究结果

1. CCT 过表达菌株的构建：成功扩增出 CCT 基因，并构建了重组质粒 pBlu-zeo18s-CCT，将其转化到裂殖壶菌 SR21 中，获得了过表达 CCT 的突变菌株 SR21-CCT。
2. 生物量、总脂质（TLs）和 DHA 产量的变化：野生型菌株在发酵早期生长优势明显，而 SR21-CCT 菌株生长延迟，但最终两者最大生物量相似。SR21-CCT 菌株的 TLs 产量比野生型菌株增加了 20.6%，DHA 产量和生产效率在整个发酵过程中均高于野生型菌株，最高值分别比野生型菌株在 96h 时增加了 75.8% 和 83.7%。
3. 脂质谱的变化：非极性脂质含量随细胞生长和脂质积累而增加，在 96h 达到峰值；极性脂质在脂质合成早期比例最高，随后逐渐下降。与野生型相比，CCT 过表达增加了极性脂质在整个细胞生长过程中的比例。
4. 脂肪酸组成的变化：CCT 过表达显著降低了 SFA 比例，增加了 PUFAs 比例，导致 PUFAs/SFAs 比值升高。在非极性和极性脂质中，DHA 比例在发酵过程中逐渐增加，且 SR21-CCT 菌株中 DHA 比例在 120h 时比野生型菌株分别增加了 51.5% 和 52.6%。
5. 磷脂（PL）谱的变化：PL 主要由 PC、PE、LPC 等组成，PC 约占总 PL 的一半。CCT 过表达改变了 PL 的组成，在 120h 时，SR21-CCT 菌株中 PC 含量增加，而 PI 含量降低。不同 PL 对脂肪酸的酯化偏好不同，PC 和 LPC 倾向于结合 PUFAs，PG 主要结合 SFAs。
6. CCT 过表达对脂质代谢途径关键基因转录水平的影响：过表达 CCT 在 60h 时，使 CLF 基因转录水平升高，FAS 基因转录水平降低；CCT 和 CPT 基因在发酵早期表达较高，且 SR21-CCT 菌株中 CCT 转录水平更高；PDCT 和 DGAT 基因转录水平下降，GPCAT 基因转录水平在发酵后期升高。

研究结论与讨论

本研究首次探讨了 CCT 在裂殖壶菌脂质代谢中的作用。CCT 过表达通过增强 PL 合成，促进了 DHA 的积累。具体来说，增加的 PC 合成使更多非酯化 DHA 酯化到 PC 中，随后转移到 DAG 形成 DHA-TAG。同时，PL 合成的增强减少了通过肯尼迪途径在 TAG 中积累的 SFA，从而通过 PC 途径增加了 PUFA 在 TAG 中的积累。

此外，研究还发现，CCT 过表达改变了 PL 的组成，增强了 PC 从头合成途径和甘油磷酸胆碱酰化途径，促进了 DHA 向 PC 的酯化和积累。同时，CCT 过表达影响了 TAG 合成途径，抑制了肯尼迪途径，加速了 PC 向 TAG 的转化。

综上所述，该研究揭示了 CCT 在裂殖壶菌脂质代谢中的重要作用，为调控细胞代谢和脂质合成提供了新的思路，也为进一步优化 DHA 生产提供了理论依据，对微生物发酵生产 DHA 的研究和应用具有重要的指导意义。