新鲜桔梗外泌体样纳米颗粒：桔梗鲜用优势的物质基础及其调节急性肺损伤的机制研究

《Journal of Nanobiotechnology》：Platycodon grandiflorum exosome-like nanoparticles: the material basis of fresh platycodon grandiflorum optimality and its mechanism in regulating acute lung injury

急性肺损伤（ALI）死亡率高且缺乏有效治疗手段，新鲜草药在治疗炎症性疾病方面或有优势。研究人员开展了桔梗（PG）外泌体样纳米颗粒（PGLNs）治疗 ALI 的研究，发现新鲜 PG 疗效优于干燥 PG，PGLNs 可调节巨噬细胞极化和代谢减轻炎症，为 ALI 治疗提供新方向。

　　急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI）是一种严重的呼吸系统疾病，死亡率高达 40%。目前全球范围内都没有有效的临床治疗方法来提高 ALI 患者的生存率，现有的治疗药物多为皮质类固醇药物，常伴有严重的不良反应，如血糖升高、体重增加、高血压、骨质钙流失以及儿童发育迟缓等。与此同时，新鲜草药在治疗炎症性疾病方面展现出比干燥草药更强的疗效，然而，对于新鲜草药疗效更好的原因却尚未完全明确。在此背景下，湖南中医药大学的研究人员开展了一系列研究，相关成果发表在《Journal of Nanobiotechnology》上。

研究人员首先构建了脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠 ALI 模型，比较新鲜桔梗（Platycodon grandiflorum，PG）和干燥 PG 对 ALI 小鼠的治疗效果。之后，利用差速离心和蔗糖密度梯度法提取并纯化 PG 外泌体样纳米颗粒（Platycodon grandiflorum exosome-Like Nanoparticles，PGLNs），通过多种技术对其进行表征和鉴定。此外，研究人员还从多个生物水平评估了 PGLNs 的生物相容性，并通过体内外实验探究了 PGLNs 对 ALI 的治疗作用及机制。

研究人员用到的主要关键技术方法包括：通过动物实验（使用 C57BL/6J 小鼠和斑马鱼）评估 PGLNs 的生物相容性和治疗效果；细胞实验（采用 RAW264.7 细胞）研究 PGLNs 对细胞的影响；运用多种检测技术，如透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）、纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）、蛋白质免疫印迹（SDS-PAGE）、蛋白质组学分析、实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）、免疫荧光、流式细胞术以及非靶向代谢组学分析等，对 PGLNs 的性质、成分以及在治疗 ALI 过程中的作用机制进行研究。

研究结果如下：

1. PG 对 LPS 诱导的小鼠肺病理损伤的改善作用：研究发现，LPS 干预后小鼠体重显著下降，肺组织出现肺泡壁增厚、间质水肿、出血、肺泡腔塌陷以及大量炎症细胞浸润等病理变化。而新鲜 PG（PF）治疗可显著恢复小鼠的一般状况和肺组织结构，减轻体重下降和炎症细胞浸润；干燥 PG（PD）治疗虽也有一定效果，但仍存在肺泡出血、间质水肿等问题。同时，PF 和 PD 均能降低肺泡灌洗液中的总蛋白含量，减少肺组织中促炎因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 表达，表明新鲜和干燥 PG 均可有效修复肺炎症损伤，且新鲜 PG 疗效更佳。
2. PGLNs 的分离与表征：研究人员成功提取并纯化了 PGLNs，TEM 观察显示其呈圆形或椭圆形囊泡，具有双层膜结构，平均直径约 90nm；NTA 结果表明其平均粒径分布为 141.2nm，颗粒含量高；Zeta 电位为 -23.5mV，稳定性和分散性良好。此外，通过琼脂糖凝胶电泳和 SDS-PAGE 电泳检测到 PGLNs 中存在核酸和蛋白质相关物质，蛋白质组学分析发现其含有多种肽和蛋白质，这些蛋白质与膜成分相关，参与信号转导和多种代谢途径。
3. PGLNs 的生物相容性：多项实验表明 PGLNs 具有良好的生物相容性。溶血试验显示不同浓度的 PGLNs 溶血活性均较低；细胞毒性试验表明 PGLNs 可促进 RAW264.7 细胞增殖；对小鼠组织器官的 H&E 染色结果显示，PGLNs 组的肝、心、脾、肺和肾组织形态与对照组相比无明显病理变化；对斑马鱼胚胎的研究也表明，PGLNs 在测试浓度下未产生明显毒性。
4. PGLNs 对 LPS 诱导的 ALI 小鼠的治疗作用：给 LPS 诱导的 ALI 小鼠尾静脉注射 PGLNs 后，发现小鼠体重下降得到明显缓解，肺组织的充血、水肿减轻，肺泡灌洗液中的总蛋白含量降低，肺组织的病理变化得到显著改善，同时肺组织中促炎因子 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 表达下调，抗炎因子 TGF-β1 的 mRNA 表达上调，表明 PGLNs 对 LPS 诱导的 ALI 小鼠具有保护作用。
5. PGLNs 对 RAW264.7 细胞极化的调节作用：通过构建 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症损伤模型，研究发现 PGLNs 可被 RAW264.7 细胞有效摄取，且能显著降低模型细胞中促炎因子 IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 表达，增加抗炎因子 IL-10 的 mRNA 表达。此外，PGLNs 还能降低 M1 型促炎细胞标志物 iNOS 的 mRNA 表达，增加 M2 型抗炎细胞标志物 Arg-1 的 mRNA 表达，细胞免疫荧光和流式细胞术结果也证实了 PGLNs 可调节巨噬细胞极化。
6. PGLNs 调节巨噬细胞极化的代谢分析：非靶向代谢组学分析显示，PGLNs 干预可影响 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞的代谢紊乱。通过分析差异代谢物发现，PGLNs 调节的代谢途径主要涉及亚油酸代谢、初级胆汁酸生物合成、甘油磷脂代谢和不饱和脂肪酸生物合成等。进一步筛选出 13 种关键差异代谢物，这些代谢物主要参与甘油磷脂代谢、维生素 B6 代谢、醚脂代谢等多种代谢途径，表明 PGLNs 可能通过调节这些代谢途径来缓解肺部炎症。

研究结论和讨论部分指出，新鲜 PG 在改善体内炎症方面比干燥 PG 更具优势，其提取物 PGLNs 在体内外均能有效改善炎症。PGLNs 可抑制 LPS 诱导的 RAW264.7 巨噬细胞炎症，减轻 LPS 诱导的小鼠 ALI，还能调节巨噬细胞代谢，包括糖酵解、脂质和氨基酸代谢途径。该研究为 ALI 的治疗提供了新的方向和潜在的治疗策略，同时也为新鲜草药的研究和应用提供了理论依据，有望推动新鲜草药在临床治疗中的应用和发展。