工程改造解脂耶氏酵母全细胞生物催化剂：基于 Lip2 脂肪酶细胞表面展示的生物柴油高效生产

《Biotechnology for the Environment》：Engineering novel Yarrowia lipolytica whole-cell biocatalysts by cell surface display of the native Lip2 lipase for biodiesel production

为解决传统生物柴油生产中酶固定化及底物运输等问题，研究人员开展了利用酵母表面展示（YSD）技术构建解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）全细胞生物催化剂的研究。结果显示，优化后的菌株在最佳条件下生物柴油转化率达 71.4%，为生物柴油生产提供了新途径。

　　在生物柴油的生产领域，传统的酶固定化方法存在诸多弊端，像是会导致酶的结构和功能发生改变，甚至使酶失活；而且酶的负载量低、容易解离，还存在传质限制以及材料成本高昂等问题。同时，与细胞表面展示（Cell Surface Display，CSD）技术相比，分泌到培养基中的游离酶在回收和功能保持方面也面临挑战，例如难以回收、在恶劣反应条件下功能易受影响等。为了突破这些困境，来自希腊研究与技术中心（Centre for Research and Technology Hellas）等机构的研究人员展开了深入研究。他们致力于开发新型解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）全细胞生物催化剂，期望能为生物柴油产业带来新的转机。此项研究成果发表在《Biotechnology for the Environment》上。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是基因工程技术，将编码解脂耶氏酵母细胞表面蛋白的 YlPIR1 基因与编码细胞外 1,3 - 区域选择性脂肪酶的 LIP2 基因进行融合，并构建多种重组表达载体，整合到酵母基因组中；其次，利用流式细胞术（Flow Cytometry）和共聚焦显微镜（Confocal Microscopy）分析启动子强度以及蛋白的定位和表达情况；此外，通过酶活性测定实验，如对硝基苯棕榈酸酯（p - nitrophenyl palmitate，pNPP）的丁醇解反应和橄榄油的甲醇解反应，来评估生物催化剂的性能。

下面来详细看看研究结果：

• Lip2 表面展示系统的构建：研究人员为了将 Lip2 脂肪酶展示在酵母细胞表面，把 YlPIR1 基因和 LIP2 基因进行融合，构建了重组整合表达盒 pYLProm - YlPIR1 - LIP2，并转化到解脂耶氏酵母细胞中。他们还测试了两个天然启动子（EXP1、H3）和一个杂交启动子（UAS1B8 - TMAL (250)），以及不同的基因组整合位点（IntE_4、IntF_3、IntC_2）对 LIP2 基因表达的影响，同时插入多个 LIP2 基因拷贝，构建了多种展示系统，以分析这些因素对酵母生理和 Lip2 活性的作用。
• 表面展示系统的评估：通过监测新构建重组菌株中报告基因 mCherry 的荧光活性，研究发现杂交启动子 UAS1B8 - TMAL (250) 和双 EXP1 天然启动子能使 mCherry 表达水平较高。共聚焦显微镜结果也证实了这一点，并且表明所有设计的质粒都适合蛋白质展示，但携带单拷贝 mCherry 的 UAS1B8 - TMAL (250) 杂交启动子菌株和携带双拷贝 mCherry 的 EXP1 天然启动子菌株荧光水平最高。
• 工程菌株的生长和酶活性：研究人员发现不同的展示系统对重组菌株的生长速率没有负面影响，但携带杂交启动子的菌株生物量最低。通过对 pNPP 丁醇解反应释放的对硝基苯酚（p - nitrophenol，pNP）进行监测，研究量化了 Lip2 催化生物量的活性。结果显示，携带单拷贝 LIP2 基因的 UAS1B8 - TMAL (250) - YlPIR1 - LIP2 IntC_2 菌株活性最高，虽然低于商业脂肪酶 Lipozyme? RM，但全细胞生物催化剂表现仍然出色。此外，IntF_3 基因组整合位点更有利于 LIP2 表达，pEXP1 启动子比 pH3 启动子能产生更高的活性，且 EXP1 IntE_4 和 H3 IntF_3 启动子组合具有协同效应。
• 生物催化生物质的大规模生产：研究人员选择了具有最高 pNPP 转酯化活性的 UAS1B8 - TMAL (250) - YlPIR1 - LIP2 IntC_2 菌株在 3 - L 台式生物反应器中进行培养。他们对比了高搅拌速度（500 - 800 rpm）和低搅拌速度（150 - 300 rpm）两种条件，发现高搅拌速度有利于生物量形成，但会降低生物催化活性；低搅拌速度虽然生物量形成较少，但能保持较高的生物催化活性。
• 利用解脂耶氏酵母细胞表面展示的 Lip2 合成生物柴油：研究人员以橄榄油为底物，在甲醇解反应中评估了酵母生物量的催化性能。他们研究了水含量、甲醇分步添加和反应介质中硅胶的存在等因素对脂肪酸甲酯（Fatty Acid Methyl Esters，FAMEs）生产的影响。结果表明，适量的水（20% v/w 油）、甲醇分步添加和添加硅胶（6% w/w 油）能显著提高生物柴油的转化率，最高可达 71.4%。此外，研究还评估了生物催化剂的可重复使用性，发现其在多次循环使用中活性会逐渐下降。
• 碳源对解脂耶氏酵母细胞表面展示的 Lip2 活性的影响：研究人员发现，在培养基中添加橄榄油、废弃烹饪橄榄油或糖蜜等碳源，能诱导 Lip2 脂肪酶的合成和展示效率。其中，废弃烹饪橄榄油的效果最为显著，可能是因为其含有较高含量的游离脂肪酸（Free Fatty Acids，FFAs）和烹饪过程中产生的分解产物，这些物质更易被代谢并诱导脂肪酶的产生。

研究结论和讨论部分指出，酵母细胞表面展示酶是构建稳定、高效且低成本全细胞生物催化剂的有利策略。尽管与其他生物柴油生产系统相比，细胞表面展示的脂肪酶稳定性和效率可能受到多种因素的影响，但酵母作为酶载体和生物催化剂具有成本效益高、易于大规模培养和细胞分离回收等优势。在本研究中，通过优化条件，工程菌株能够高效地从橄榄油甲醇解反应中生产生物柴油，展现出了作为全细胞催化剂的潜力。此外，利用废弃烹饪油作为碳源大规模生产全细胞生物催化剂，为工业生物技术应用提供了广阔的前景。然而，为了进一步提高生物催化剂的性能，还需要优化反应条件、改进细胞表面工程等。这项研究为生物柴油的生产提供了新的思路和方法，对推动生物柴油产业的发展具有重要意义。