联合抗 PD-L1 和抗 VEGFR2 疗法：重编肿瘤微环境，为胶质母细胞瘤治疗带来新曙光

《Cell Death Discovery》：Combined anti-PD-L1 and anti-VEGFR2 therapy promotes the antitumor immune response in GBM by reprogramming tumor microenvironment

胶质母细胞瘤（GBM）临床治疗效果差，免疫治疗对多数患者疗效不佳。研究人员开展联合抗 PD-L1 和抗 VEGFR2 疗法治疗 GBM 的研究。结果显示该联合疗法可调节肿瘤微环境（TME），抑制 GBM 细胞免疫逃逸，延长小鼠生存期，为 GBM 治疗提供新思路。

　　胶质母细胞瘤（Glioblastoma multiforme，GBM）是成人中枢神经系统中最常见的原发性恶性肿瘤，就像隐藏在大脑深处的 “恶魔”，严重威胁着患者的生命健康。目前，GBM 的标准治疗方案是手术结合术后同步放化疗，但患者预后依旧很差，平均生存期仅有约 8 个月。近年来，免疫疗法虽逐渐应用于临床试验，其中针对程序性死亡受体 1（PD-1）和程序性死亡配体 1（PD-L1）的免疫检查点抑制剂（ICIs）可调节机体免疫反应来发挥抗肿瘤作用，然而，临床研究表明，PD-1/PD-L1 抑制剂免疫疗法对包括 GBM 在内的高级别胶质瘤患者的总生存期改善并不明显。这是因为 GBM 具有很强的免疫抑制特性，其肿瘤微环境（Tumor microenvironment，TME）中存在众多免疫抑制细胞和功能失调的效应 T 细胞，使得免疫细胞难以发挥作用，从而导致治疗失败。此外，GBM 的肿瘤血管新生异常，血管扭曲、渗漏，不仅影响组织的血液灌注，还阻碍了免疫细胞向肿瘤部位的浸润，进一步限制了免疫治疗的效果。

在这样的背景下，苏州大学附属第一医院的研究人员决心探索新的治疗方法，以攻克 GBM 这一难题。他们开展了联合抗 PD-L1 和抗 VEGFR2（血管内皮生长因子受体 2）疗法治疗 GBM 的研究，相关成果发表在《Cell Death Discovery》上。该研究意义重大，为 GBM 的临床治疗提供了新的理论依据和潜在的治疗策略。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。首先，通过生物信息学分析，对来自癌症基因组图谱（TCGA）和中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）的数据集进行挖掘，评估相关基因的表达情况。接着，利用免疫组化、蛋白质免疫印迹（Western blotting）、实时定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）等技术，检测基因和蛋白的表达水平。同时，借助慢病毒转染技术构建相关细胞模型，使用流式细胞术分析细胞周期、凋亡以及 T 细胞的功能。此外，还建立了小鼠颅内移植瘤模型，进行体内实验验证。

研究结果如下：

• PD-L1 和 VEGFR2 在高级别胶质瘤中的表达及与患者生存的关系：分析 TCGA 和 CGGA 数据库发现，PD-L1 和 VEGFR2 的 mRNA 水平在高级别胶质瘤中高于低级别胶质瘤。通过免疫组化检测正常和不同级别胶质瘤组织中 PD-L1 和 VEGFR2 的表达，结果显示它们在高级别胶质瘤中表达更高。Kaplan-Meier 分析表明，PD-L1 和 VEGFR2 表达低的患者生存期更长。
• 抗 PD-L1 和抗 VEGFR2 疗法对 GBM 细胞的影响：敲低 VEGFR2 基因后，GBM 细胞出现细胞周期阻滞在 G₂/M 期，但对细胞凋亡无影响。ELISA 检测发现，敲低 VEGFR2 后，白细胞介素 - 7（IL-7）和白细胞介素 - 12（IL-12）浓度显著增加。将激活的 CD8⁺ T 细胞与 GBM 细胞共培养，单独使用抗 PD-L1 或抗 VEGFR2 疗法可诱导 GBM 细胞凋亡，联合使用效果更明显，且联合疗法能促进免疫细胞对 GBM 细胞的毒性作用。
• VEGFR2 对 PAK4 表达及肿瘤微环境相关基因的影响：RNA 测序结果显示，敲低 VEGFR2 后，921 个基因表达上调，1208 个基因表达下调。其中，PAK4（P21 激活激酶 4）表达显著下调，IL-7、IL-12 和细胞间黏附分子 - 1（ICAM-1）等 TME 相关基因表达上调。通过对 TCGA 和 CGGA 数据库分析、免疫组化及蛋白质免疫印迹检测，发现 PAK4 在高级别胶质瘤中高表达，且与 WHO 分级正相关，与 CD8⁺ T 细胞免疫评分呈负相关。
• VEGFR2 调节 PAK4 表达的机制：qRT-PCR 分析表明，敲低 VEGFR2 可显著下调 PAK4 表达。蛋白质免疫印迹和免疫荧光染色显示，敲低 VEGFR2 后，VEGFR2、PAK4 和磷酸化 STAT3（p-STAT3）表达下降，而 STAT3 表达不变。生物信息学预测及染色质免疫沉淀 - 定量 PCR（ChIP-qPCR）实验证实，p-STAT3 与 PAK4 基因启动子区域结合，调节 PAK4 表达。共免疫沉淀（Co-IP）实验表明，VEGFR2 与 STAT3 直接结合。
• PAK4 对 GBM 细胞抗肿瘤免疫反应的影响：敲低 GBM 细胞中的 PAK4，与激活的 CD8⁺ T 细胞共培养后，GBM 细胞凋亡增加。而过表达 PAK4 则可减少抗 VEGFR2 疗法诱导的 GBM 细胞凋亡，这表明 PAK4 水平影响免疫细胞对 GBM 细胞的毒性和 GBM 细胞的免疫逃逸。
• 联合疗法对 CD8⁺ T 细胞功能及体内肿瘤生长的影响：体外实验中，联合抗 PD-L1 和抗 VEGFR2 疗法可促进 CD8⁺ T 细胞分泌干扰素 -γ（IFN-γ）、颗粒酶 B（GZMB）和穿孔素，降低 PD-1 表达，减少 T 细胞耗竭。体内实验中，建立小鼠颅内移植瘤模型，结果显示联合疗法显著抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期。免疫组化和免疫荧光分析表明，联合疗法可改变 TME，增强颅内 CD8⁺ T 细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。

研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 VEGFR2 与 STAT3 结合并磷酸化，进而影响 PAK4 转录的分子机制。联合抗 PD-L1 和抗 VEGFR2 疗法可增加 CD8⁺ 细胞毒性 T 细胞浸润，在 GBM 模型中有效。然而，研究也存在局限性，如对 PAK4 调节 CD8⁺ T 细胞的具体机制还需深入研究，以及抗 VEGFR2 疗法对 GBM TME 中其他细胞的影响也有待探索。但总体而言，该研究为 GBM 的临床治疗提供了科学、客观的理论基础，为抗血管生成药物和免疫疗法在 GBM 治疗中的应用开辟了新方向，有望为 GBM 患者带来新的希望，推动 GBM 治疗领域的进一步发展。