肝细胞和巨噬细胞中 Tfap2a 缺失促进肝癌进展：揭示 AP-2α 调控新机制及潜在治疗靶点

《Cell Death & Disease》：Deletion of Tfap2a in hepatocytes and macrophages promotes the progression of hepatocellular carcinoma by regulating SREBP1/FASN/ACC pathway and anti-inflammatory effect of IL10

为探究转录因子 AP-2α 在肝癌（HCC）发病机制中的作用，湖南师范大学研究人员构建多种 Tfap2a 基因敲除小鼠模型及相关细胞模型开展研究。结果发现，肝细胞或巨噬细胞中 Tfap2a 缺失会促进肝癌发展。这为 HCC 治疗提供了新靶点，意义重大。

　　肝癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）作为全球范围内常见且致命的原发性肝脏恶性肿瘤，严重威胁人类健康。目前，虽然对肝癌的研究取得了一定进展，但仍有诸多关键问题亟待解决。比如，肝癌发生发展的具体分子机制尚未完全明确，这使得在寻找有效治疗靶点和开发精准治疗策略时面临困境。而且，肝癌患者的预后普遍较差，五年生存率较低，现有的治疗手段难以满足临床需求。在这样的背景下，为了深入探究肝癌的发病机制，寻找新的治疗靶点，湖南师范大学的研究人员开展了一系列研究。

研究人员通过构建多种基因敲除小鼠模型，包括肝细胞（Alb-Cre）、肝星状细胞（HSC，Lrat-Cre）和巨噬细胞（LysM-Cre）特异性 Tfap2a 基因敲除小鼠，以及 DEN/CCl₄诱导的肝纤维化和 HCC 小鼠模型，同时结合细胞实验，对 AP-2α 在肝癌发生发展中的作用进行了深入研究。研究结果发表在《Cell Death and Disease》上。

在研究方法上，研究人员主要运用了以下关键技术：一是基因编辑技术，利用 CRISPR/Cas9 系统构建 Tfap2a 基因敲除小鼠模型；二是细胞培养与转染技术，培养肝癌细胞系并进行质粒和 siRNAs 转染；三是多种分子生物学检测技术，如 qRT-PCR（定量逆转录聚合酶链反应）检测基因表达水平、Western blotting 检测蛋白质表达、免疫组化（IHC）和免疫细胞化学（ICC）分析蛋白定位与表达等；四是脂质组学分析技术，用于检测肝脏脂质变化；五是染色技术，如 H&E 染色（苏木精 - 伊红染色）观察组织形态、Oil Red O 染色检测脂质积累等。

研究结果如下：

1. Tfap2a 在 DEN/CCl₄诱导的 HCC 小鼠模型中表达下调：构建 DEN/CCl₄诱导的肝纤维化和原发性 HCC 小鼠模型后，研究人员发现，与对照组相比，模型小鼠肝脏中 Tfap2a 的 mRNA 水平降低，同时伴有脂质代谢异常，如脂质合成相关基因和蛋白表达增加，β - 氧化和脂质转运相关蛋白表达下降。这表明肝脏损伤 / 纤维化 / HCC 的发展可能与 AP-2α 表达下调以及 DNL（de novo lipid，从头脂质）合成途径相关。
2. Tfap2a 在肝细胞和巨噬细胞中缺失促进肝脂肪变性：构建 Tfap2a 基因敲除小鼠后，研究发现，正常饮食 1 个月时，Tfap2a^ΔMΦ小鼠肝脏 TG（甘油三酯）含量增加，肝细胞出现气球样肿胀和脂滴积累；Tfap2a^ΔHep小鼠在 3 - 6 个月时也出现类似情况，且 1 个月时葡萄糖耐量和胰岛素抵抗改善。这说明敲除 Tfap2a 会导致肝细胞 TG 积累，阻碍肝脏脂质代谢，而肝星状细胞中 Tfap2a 缺失对小鼠肝脏无显著影响。
3. 巨噬细胞中 Tfap2a 缺失导致 M1 巨噬细胞极化并加速 HCC 发生：在 Tfap2a^ΔMΦ小鼠肝脏中，研究人员发现 M1 巨噬细胞标记物 iNOS 表达增加，M2 巨噬细胞标记物 Cd206 表达下调，体外诱导实验也证实 Tfap2a 敲除减少了 M2 巨噬细胞的比例。同时，Tfap2a^ΔMΦ小鼠肝脏中促炎细胞因子增加，抗炎细胞因子 IL-10 减少。构建 DEN/CCl₄诱导的 Tfap2a^ΔMΦ小鼠模型后，发现其肝脏肿瘤结节增多，脂质水平升高，脂质组学分析显示甘油三酯等脂质大量积累。这表明巨噬细胞中 AP-2α 缺失会导致肝脏炎症和脂肪变性，进而加速 HCC 的发生。
4. 肝细胞中 Tfap2a 缺失加速 DEN/CCl 介导的 HCC 发生：构建 DEN/CCl 介导的 HCC 模型后，研究发现 Tfap2a^ΔHep小鼠肝脏肿瘤结节数量和肿瘤与肝脏面积比增加，脂质水平升高，脂质组学分析显示甾醇脂质和甘油脂质等上调，相关蛋白表达也发生变化，同时出现内质网应激。这说明在 DEN/CCl 诱导下，肝细胞中 Tfap2a 缺失会促进脂质合成，导致肝细胞 TG 积累，加速 HCC 形成。
5. AP-2α 结合 SREBP1/ACC/FASN 基因启动子并抑制从头脂肪生成：通过生物信息学分析、双荧光素酶报告基因实验、EMSA（电泳迁移率变动分析）和 ChIP（染色质免疫沉淀）实验，研究人员证实 AP-2α 能直接结合 SREBP1、ACC 和 FASN 基因的启动子，抑制其转录活性。敲低或过表达 AP-2α 会相应地影响这些基因的蛋白表达水平。这表明 AP-2α 通过直接作用于关键基因启动子，抑制 DNL 合成途径。
6. m6A 修饰降低 HCC 中 AP-2α mRNA 的稳定性：研究发现 AP-2α 基因存在 m6A 修饰位点，干扰 m6A 甲基化酶 WTAP 和 “reader” 蛋白 YTHDC1 后，AP-2α 表达上调，脂质积累减少。在 DEN/CCl₄诱导的小鼠肝脏中，WTAP 和 YTHDC1 蛋白水平增加。这说明 WTAP 通过 m6A - YTHDC1 途径抑制 AP-2α 表达，影响肝癌发生发展。
7. 临床肝脏疾病样本中 AP-2α 下调与 WTAP、YTHDC1 和 FASN 表达上调相关：分析临床肝脏疾病样本发现，与健康肝脏组织相比，NAFLD（非酒精性脂肪性肝病）/NASH（非酒精性脂肪性肝炎）和 HCC 样本中 AP-2α 蛋白水平下调，而 WTAP、YTHDC1 和 FASN 表达上调，且 AP-2α 与这些蛋白表达呈负相关。这进一步验证了 m6A RNA 修饰和 AP-2α 调节在 HCC 进展中的重要作用。

研究结论和讨论部分指出，本研究系统地揭示了 Tfap2a 在与纤维化、炎症或脂质代谢紊乱相关的 HCC 中的具体功能。肝细胞和巨噬细胞中 AP-2α 缺失会导致肝脏脂质代谢紊乱，其机制各不相同。AP-2α 作为脂质代谢和炎症反应的关键调节因子，通过抑制 SREBP1c/ACC/FASN 介导的脂肪生成以及调节巨噬细胞极化和炎症细胞因子分泌，在肝癌发生发展中发挥抑制作用。m6A 相关调节因子 WTAP 和 YTHDC1 通过影响 AP-2α mRNA 稳定性，参与肝癌的发病过程。这些发现为肝癌的治疗提供了新的潜在靶点，靶向 WTAP - AP-2α 轴可能成为治疗脂质代谢紊乱诱导的肝纤维化和 HCC 的新策略。然而，在从 NAFLD 到 HCC 的过程中，AP-2α 介导的分子网络仍有待进一步明确，内质网应激与 AP-2α 在脂质代谢紊乱相关 HCC 过程中的关系也需要深入研究。本研究为肝癌的基础研究和临床治疗提供了重要的理论依据，有望推动肝癌治疗领域的新突破。