综述：基因治疗为先天性静止性夜盲症的未来治愈带来希望

《Journal of Translational Medicine》：Gene therapy shines light on congenital stationary night blindness for future cures

这篇综述聚焦先天性静止性夜盲症（CSNB）。详细阐述了其临床诊断、发病机制、相关突变基因，介绍了多种动物模型。重点探讨基因治疗技术在视网膜遗传疾病及 CSNB 治疗中的应用，分析面临的挑战，为该领域研究提供全面参考。

　　

一、先天性静止性夜盲症（CSNB）概述

先天性静止性夜盲症是一种非进行性遗传性眼病，主要影响视网膜信号处理，导致患者在低光条件下视力显著下降。视网膜在视觉信号形成中起着关键作用，当光线进入眼睛，经过折射后到达视网膜，视网膜中的光感受器细胞将光信号转化为电信号，再通过双极细胞（BCs）和神经节细胞传递到大脑视觉中心。然而，一些与视网膜结构相关的基因突变会破坏这种正常的信号传递，引发视觉障碍，CSNB 就是其中之一。

二、CSNB 的临床诊断

CSNB 患者的临床表现多样，除了夜盲这一主要症状外，还可能伴有近视、远视、斜视、眼球震颤、视力下降以及眼底异常等症状。眼底表现因 CSNB 亚型而异，部分患者眼底正常，部分则存在异常。在诊断 CSNB 时，除了进行眼底检查外，全视野视网膜电图（ffERG）是必不可少的手段。ffERG 通过记录角膜电极对闪光刺激的电反应来评估视网膜功能，包括暗适应（DA）和光适应（LA）状态下的功能评估。根据不同的 ERG 波形特征，可将 CSNB 进一步分类，如 Schubert-Bornschein 型和 Riggs 型等。

三、CSNB 的临床特征分类

1. 异常眼底 CSNB
   • Oguchi 病（OD）：患者表现为先天性夜盲，但色觉、视力和视野正常。眼底有特征性的 Mizuo-Nakamura 现象，即金黄黄色病变在长时间暗适应后消失。ERG 检查显示，短暂暗适应后，DA 0.01 条件下 b 波显著降低或消失，DA 10.0 时 a 波和 b 波均降低；长时间暗适应后，a 波和 b 波可恢复接近正常水平，但再次测试又会恢复异常，光适应下 ERG 通常正常。
   • 眼底白点症（Fundus albipunctatus，FA）：也是常染色体隐性遗传疾病，患者有夜盲和暗适应延迟症状。眼底有明显异常，在中周边和后部区域（除黄斑外）出现白色斑点，这些斑点可能随时间变化。ERG 检查发现，DA 0.01 条件下 b 波严重降低或消失，DA 10.0 时 b 波和 a 波均降低，不过长时间暗适应后，多数患者的 ERG 结果趋于正常。
2. 正常眼底 CSNB
   • Schubert-Bornschein 型 CSNB：患者眼底正常，暗适应 ERG 表现为 a 波正常但 b 波消失。这是 CSNB 最常见的形式，存在常染色体隐性和 X 连锁遗传模式，还可进一步分为不完全性 CSNB（icCSNB）和完全性 CSNB（cCSNB）。icCSNB 患者的 ON 型和 OFF 型双极细胞均有功能障碍，ERG 显示 DA 0.01 时 b 波降低但不消失，DA 10.0 时仅 b 波下降；光适应下，LA 30 Hz ERG 反应显著减弱和延迟，LA 3.0 时 a 波和 b 波均降低。cCSNB 患者主要是 ON 型双极细胞功能障碍，DA 0.01 时 b 波完全消失，DA 10.0 时 b 波显著降低，光适应下 LA 3.0 和 30 Hz 时波形振幅正常但波谷变宽，LA 3.0 时 a 波正常但波谷仍宽且 b 波变陡。
   • Riggs 型 CSNB：以视杆光感受器功能障碍为特征，暗适应下 ERG 反应显著降低，DA 0.01 时 b 波严重降低或消失，DA 10.0 时 b 波和 a 波均下降，光适应下 ERG 结果与正常相当。该型 CSNB 包括常染色体显性和隐性遗传模式，患者夜盲症状相对较轻，少数有近视。
3. GNB3 基因相关 CSNB：该类型 CSNB 表型独特，目前报道病例较少且表型多样。暗适应下，DA 0.01 或 DA 10.0 时 b 波降低，a 波正常；光适应下，ERG 反应在 LA 3.0 和 30 Hz 时可能减弱或延迟，a 波可能延迟，b 波减弱且延迟。长时间刺激显示 ON 型双极细胞反应异常，患者可能有夜盲、近视和眼球震颤，但并非所有患者都有这些症状。

四、CSNB 分子病理学

CSNB 的遗传模式包括 X 连锁、常染色体隐性和显性遗传。相关突变基因众多，可大致分为两类：一类主要导致光感受器中视杆光转导功能障碍，如 Riggs、FA 和 OD 相关突变；另一类影响光感受器与双极细胞之间的信号通路，与 cCSNB 和 icCSNB 相关。

1. 视杆光转导级联相关基因突变：Riggs 型 CSNB 中，RHO、SLC24A1、PDE6B 和 GNAT1 等基因发生突变。这些基因编码的蛋白在视杆光转导级联中起关键作用，突变会导致视杆细胞功能障碍。例如，RHO 基因突变可使视紫红质异常，影响光信号转导；SLC24A1 基因编码的转运蛋白与细胞内 Ca²⁺稳态有关，其突变机制尚待进一步研究。在 FA 型 CSNB 中，RDH5 基因突变影响 11 - 顺视黄醇向 11 - 顺视黄醛的转化，患者眼底会出现 “漂白” 样白色斑点。OD 型 CSNB 主要涉及 SAG 和 GRK1 基因突变，这两个基因对关闭光转导级联至关重要，突变会使视紫红质在光刺激下持续激活，不过长时间暗适应后，患者眼底和 ERG 结果可能恢复正常。
2. 与 Schubert-Bornschein 型 CSNB 相关的遗传缺陷：光感受器与双极细胞之间的信号传递依赖于突触处神经递质的释放。相关基因突变会影响这一过程，导致 CSNB。例如，CACNA1F、CABP4 和 CACNA2D4 等基因的突变影响电压门控 Ca²⁺通道（Cav1.4）的功能，进而影响谷氨酸的释放，引发 icCSNB。双极细胞分为 ON 型和 OFF 型，它们表达不同的谷氨酸受体，对光刺激的反应不同。ON 型双极细胞表达代谢型谷氨酸受体 6（GRM6/mGluR6），对光产生去极化反应；OFF 型双极细胞表达离子型谷氨酸受体，在光刺激下超极化。这种受体表达差异解释了 icCSNB 患者的不同表型。在 cCSNB 中，GRM6、GPR179、LRIT3、TRPM1 和 NYX 等基因突变导致 ON 型双极细胞功能障碍，使 ERG 中 b 波缺失。
3. GNB3 基因相关缺陷：GNB3 基因编码 G 蛋白异源三聚体的 β3 亚基，该基因双等位基因突变会导致 G 蛋白复合物功能障碍，使患者出现双分子表型和视锥光感受器敏感性降低。

五、CSNB 相关动物模型

动物模型是研究 CSNB 的重要工具，有助于揭示其发病机制和探索治疗方法。许多 CSNB 动物模型通过自然发生的突变或人工构建获得，其中利用基因组编辑技术可直接创建带有特定突变基因的动物模型。基因人源化动物模型则通过同源定向修复（HDR）等技术，用特定人类基因原位替换动物基因，能更好地模拟人类基因组结构，为临床前研究提供更有价值的数据。目前已建立多种 CSNB 动物模型，如小鼠、马、狗等，这些模型在研究疾病病理特征和评估治疗效果方面发挥了重要作用，但在将结果外推至人类时，需考虑物种间的组织和遗传差异。

六、基因治疗的原理和方法

基因治疗旨在通过基因编辑或替换等方法纠正体内异常基因表达，恢复正常蛋白质功能和细胞信号传导，主要方法包括基因替换疗法、基因编辑疗法和基因调控疗法。

1. 基因替换疗法：该方法利用病毒或非病毒载体将健康基因导入视网膜细胞，替换缺陷基因，适用于单基因遗传病的治疗。例如，FDA 批准的首个眼科基因治疗药物 Luxturna，通过 AAV2 载体将正常的 RPE65 基因导入患者体内，成功治疗了由 RPE65 基因突变引起的莱伯先天性黑朦（LCA）。然而，基因替换疗法存在载体包装容量有限、需要持续给药以及治疗效果受基因表达影响等问题。
2. 基因编辑疗法：基因编辑疗法有望实现终身治愈，早期主要使用锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活样效应核酸酶（TALENs），但因其过程复杂、所需组件多，在遗传性视网膜疾病中的应用受限。近年来，CRISPR 基因编辑系统成为热门工具，其中最常用的是 II 型 CRISPR/Cas9 蛋白。在 sgRNA 的引导下，CRISPR/Cas9 可诱导 DNA 双链断裂（DSBs），主要通过同源定向修复（HDR）和非同源末端连接（NHEJ）两条途径进行修复。由于大多数视网膜细胞处于有丝分裂后期，HDR 在视网膜细胞中的编辑效率较低。为此，人们开发了微同源介导的末端连接（MMEJ）、同源独立靶向整合（HITI）和单同源臂供体介导的靶向整合（SATI）等方法来提高编辑效率。此外，基于 CRISPR 系统还开发了碱基编辑器（BEs）和引导编辑器（PE）等变体。BEs 可在不产生 DSBs 的情况下诱导单碱基突变，理论上能纠正 30% 的人类致病突变；PE 则能引入各种点突变，且不产生 DSBs，无旁观者编辑风险。目前，基因编辑疗法在其他遗传性视网膜疾病（IRD）治疗中已有应用，但在 CSNB 治疗方面尚未见报道。
3. 基因调控：通过反义寡核苷酸（ASOs）和 RNA 干扰（RNAi）进行基因调控。ASOs 是短寡核苷酸，可通过与 RNA 转录本碱基配对来调节基因表达，主要通过降解 RNA 转录本或阻碍前体 mRNA 的正常剪接来实现。例如，ProQR 开发的 ASO 疗法 Sepofarsen 用于治疗 LCA10，虽在部分患者中显示出一定疗效，但也存在不良反应。RNAi 则是利用约 19 - 22 个核苷酸长的双链 RNA（siRNA），与蛋白质结合形成 RNA 诱导沉默复合体（RISC），切割和降解 RNA，从而沉默突变 RNA。在年龄相关性黄斑变性（AMD）治疗中，已有相关临床药物，但同样存在不良反应问题。对于 CSNB，基因替换疗法适用于大多数患者，基因编辑理论上可适用于所有类型突变，而 ASO 和 RNAi 在 CSNB 治疗中的应用相对有限，如 ASO 更适用于由 RNA 剪接错误引起的 CSNB。

七、递送策略选择

有效的视网膜疾病基因治疗需要将药物安全、高效地递送至靶组织。目前，视网膜疾病的主要给药途径是玻璃体内注射（IVT）和视网膜下注射（SRI）。IVT 操作相对安全简单，但药物在玻璃体内的扩散受多种因素影响，如玻璃体液的稀释、免疫反应的干扰、内界膜的屏障作用以及扩散距离等。SRI 能将药物直接注入视网膜下间隙，免疫反应较小，但该方法需要精确操作，否则可能导致视网膜脱离。药物递送需要合适的载体，视网膜药物载体分为病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括慢病毒、腺病毒和腺相关病毒（AAV）等，其中 AAV 因对不同视网膜结构具有不同的嗜性、不诱导疾病且大小适中，成为眼部基因治疗的首选病毒载体。AAV 的关键在于血清型的选择，不同血清型的 AAV 靶向能力和递送效率不同。目前，通过合理设计和定向进化等方法可获得更理想的 AAV 血清型，但使用 AAV 时需考虑其包装容量和潜在的免疫反应问题。非病毒载体如脂质纳米颗粒（LNPs）和病毒样颗粒（VLPs）也在研究中，LNPs 在 COVID - 19 疫苗的应用中受到关注，其安全性已在临床得到验证，且具有模块化设计的优点；VLPs 则广泛用于疫苗开发，具有高包装容量、低免疫原性等优势，但目前大多数基于 VLPs 的药物递送研究仍处于临床前阶段。

八、CSNB 治疗的研究综述

目前，CSNB 尚无已发表的临床疗法，但研究人员在哺乳动物模型上进行了多种尝试。针对 Nyx 基因突变导致的 CSNB 小鼠模型（Nyx^nob小鼠），Miranda 团队使用 AAV2 (quadY - F + TV)-Ple155 - YFP_Nyx 进行玻璃体内注射，结果显示，出生后第 2 天（P2）治疗的小鼠 b 波得到挽救，TRPM1 蛋白定位恢复，但出生后第 30 天（P30）治疗的小鼠未出现挽救效果。对于 Lrit3 基因突变的 Lrit3^-/-小鼠，Nazarul 团队采用基因替换疗法，使用 rAAV RHO::Lrit3 进行治疗，发现出生后第 5 天（P5）治疗的小鼠 TRPM1 转运恢复，暗适应 ERG 中 b 波平均恢复率达 50%，成年小鼠（P35）治疗也有一定效果，但疗效不如 P5 治疗的小鼠。Juliette 团队在治疗 Grm6^-/-小鼠时发现，虽然 AAV2 - 7m8 治疗可恢复 mGluR6 表达，但 ERG 表型未恢复，可能是由于早期视网膜发育中 GRM6 缺失导致的结构畸形。随后，该团队在成年 Lrit3^-/-小鼠治疗中取得较好效果，注射 AAV2 - 7m8 后，小鼠的 LRIT3 表达和 TRPM1 定位恢复，暗适应 ERG 中 b 波恢复率达 58%。在大动物模型研究中，Takahashi 团队利用野生型 CSNB 比格犬模型，筛选出 AAV K9#12 进行实验，使用不同启动子设计组合策略，发现注射 AAV - shGRM6 - cLRIT3 - WPRE 可使成年比格犬的 ERG b 波稳定恢复，恢复水平可达野生型的 30%，且效果可持续较长时间。

九、结论和展望

CSNB 患者常表现为夜盲，由于其遗传异质性高，临床特征与其他 IRD 存在重叠，仅依靠临床观察难以准确诊断，ffERG 在 CSNB 诊断中具有重要意义。CSNB 主要由基因突变引起，相关基因多位于光感受器和双极细胞中。虽然基因治疗在 CSNB 动物模型研究中取得了一定成果，但临床研究仍面临诸多挑战，如致病基因的准确鉴定、高效精准的药物递送策略、高昂的治疗成本以及安全性问题等。未来，随着对 CSNB 相关基因及其分子通路研究的不断深入，有望克服这些挑战，使基因治疗成为 CSNB 患者恢复正常视觉功能、提高生活质量的有效手段。