早期内溶酶体功能障碍：钆基造影剂致小鼠肾小管上皮细胞损伤的关键因素

《Cell Biology and Toxicology》：Early endolysosomal dysfunction is a contributing factor to gadolinium-based contrast agent mouse renal proximal tubule epithelial cell injury

为探究钆基造影剂（GBCAs）的肾毒性机制，研究人员以小鼠肾小管上皮细胞为研究对象，发现 GBCAs 暴露会引发细胞活力降低、溶酶体损伤、Cathepsins 加工异常和线粒体功能障碍，这为理解 GBCAs 毒性及寻找治疗靶点提供了依据。

　　在现代医学领域，磁共振成像（MRI）是极为重要的诊断手段，钆基造影剂（GBCAs）因其出色的增强效果，在多种疾病诊断中发挥着关键作用。然而，随着 GBCAs 使用的日益广泛，其安全性问题逐渐凸显。GBCAs 中的重金属钆（Gd³⁺）具有潜在毒性，可能从螯合剂中释放，对人体造成危害。特别是在肾功能不全患者中，使用 GBCAs 后出现了多器官纤维化等严重不良反应，即肾源性系统纤维化（NSF）。尽管 GBCAs 的临床应用广泛，但目前对于其在分子和细胞层面的毒性作用机制仍知之甚少。因此，深入研究 GBCAs 的毒性机制，对于保障患者的安全、优化临床使用具有重要意义。

为了揭开 GBCAs 毒性机制的神秘面纱，美国新墨西哥大学健康科学中心肾脏研究所（Kidney Institute of New Mexico, University of New Mexico Health Sciences Center）的研究人员展开了一项深入研究。该研究成果发表在《Cell Biology and Toxicology》杂志上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，培养小鼠肾近端小管上皮细胞（MRPTEpiCs），用 GBCAs 进行处理。通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测量细胞内钆浓度，以此反映 GBCAs 的摄取情况；运用 XTT 细胞活力检测法评估细胞代谢活性，判断细胞活力；利用 LysoTracker Red 染色、免疫荧光、透射电子显微镜（TEM）等技术，观察细胞内溶酶体的变化；借助多重荧光 western blotting 技术分析相关蛋白的表达水平；使用 MitoTracker Red-FM 活细胞成像和线粒体网络分析、测量线粒体膜电位等方法，探究线粒体功能。

研究结果如下：

1. GBCAs 的摄取与细胞损伤：通过 ICP-MS 分析发现，细胞内钆浓度随 GBCA 处理时间增加而升高，表明细胞能摄取 GBCAs。XTT 实验显示，24 小时线性 GBCA 处理会降低细胞代谢活性，同时肾脏损伤分子 - 1（KIM-1）蛋白水平增加，证明线性 GBCAs 会对肾近端小管上皮细胞造成损伤。
2. 内溶酶体系统的变化：LysoTracker Red 染色结果表明，GBCA 处理会导致溶酶体完整性改变，4 小时时染色降低，24 小时时荧光显著增强，且 LTR 阳性斑点数量增加，意味着溶酶体生物发生增加。进一步研究发现，GBCA 暴露会使溶酶体相关膜蛋白 1（LAMP-1）阳性溶酶体增大，半乳糖凝集素 - 3（Galectin-3）重新分布，提示溶酶体损伤。TEM 观察到 4 小时暴露时细胞内出现大量扩大的囊泡，24 小时时细胞器肿胀和空泡形成，线性暴露组还出现核碎片化。
3. 溶酶体功能障碍与膜通透性改变：监测半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶 B（CTSB）和天冬氨酸蛋白酶组织蛋白酶 D（CTSD）的表达和定位发现，4 小时 GBCA 暴露会干扰 CTSB 成熟，降低 proCTSD 水平，影响 CTSD 成熟。免疫荧光显示，GBCA 暴露会导致 CTSB 和 CTSD 从溶酶体腔转移到细胞质，表明发生了部分溶酶体膜通透化（pLMP）。
4. 对线粒体功能和细胞活力的影响：4 小时 GBCA 暴露对线粒体形态和膜电位无明显影响，但 24 小时线性 GBCA 暴露会导致线粒体网络结构缩短、膜电位崩溃，细胞活力降低。使用溶酶体蛋白酶抑制剂共处理后，可改善线粒体形态和功能，挽救细胞活力，说明线性 GBCA 诱导的 pLMP 会影响线粒体功能和细胞活力，且这种影响与组织蛋白酶有关。

研究结论和讨论部分指出，该研究首次深入揭示了 GBCAs 损害溶酶体功能、诱导 pLMP 以及影响线粒体功能的机制。研究发现，GBCAs 会被细胞摄取并在溶酶体中积累，导致溶酶体增大和组织蛋白酶加工异常，进而引发溶酶体功能障碍。pLMP 的发生使溶酶体中的组织蛋白酶释放到细胞质中，影响线粒体功能，最终导致细胞损伤。这一研究为理解 GBCAs 的肾毒性提供了重要依据，也为寻找潜在的治疗靶点以减轻 GBCAs 的毒性作用奠定了基础。然而，该研究也存在一定局限性，如使用的是二维体外模型，可能无法完全反映临床情况，后续还需进一步研究其他溶酶体内容物以及在其他器官中的作用。但总体而言，该研究成果为未来更深入地研究 GBCAs 的毒性机制和开发针对性治疗策略提供了重要方向。