突破纳他霉素生产瓶颈：原生质体融合与转录组分析协同增效

《Microbial Cell Factories》：Enhanced Natamycin production in Streptomyces gilvosporeus through phosphate tolerance screening and transcriptome-based analysis of high-yielding mechanisms

为解决纳他霉素（Natamycin）生产菌株生物合成能力低，限制工业化及应用的问题，研究人员开展了通过磷酸盐耐受性筛选和转录组分析提高纳他霉素产量的研究。结果获得高产菌株 GR-2，产量提升，明确关键代谢途径和调控因子，为菌株改良提供策略。

　　在生物制药和食品保鲜领域，纳他霉素是一位 “明星分子”。它是一种具有独特 26 元内酯环结构的天然多烯大环内酯抗生素，凭借与真菌细胞膜中麦角固醇结合的能力，展现出强大的广谱抗真菌活性。正因如此，它在 40 多个国家被批准作为天然食品防腐剂，还在医学和农业领域大显身手，用于治疗真菌感染、对抗癌症以及保护农作物。然而，这位 “明星” 却面临着生产困境。目前，纳他霉素主要由多种链霉菌通过有氧浸没发酵合成，但生产菌株的合成效率较低，传统的发酵优化方法难以实现产量的大幅提升。同时，传统的菌株改良手段，如物理化学诱变和抗性筛选，存在诱导基因突变数量有限、耗时久的问题，而基因工程虽有效，但由于细胞代谢复杂，纳他霉素合成的调控机制尚不明确，限制了其应用。在这样的背景下，江南大学的研究人员开展了一项旨在提升纳他霉素产量的研究，该研究成果发表在《Microbial Cell Factories》上。

研究人员采用了一系列关键技术方法。首先，通过原生质体融合结合磷酸盐耐受性筛选，构建突变体库并筛选高产菌株。然后，运用转录组测序技术分析高产菌株和原始菌株的基因表达差异，挖掘潜在的关键代谢途径和遗传元件。此外，还进行了氨基酸添加、基因过表达和基因沉默等实验，验证相关基因和代谢途径对纳他霉素产量的影响。

在研究结果方面：

1. 高产菌株的获得：通过 ARTP 和 DES 诱变结合磷酸盐耐受性筛选，分别得到高产突变体 AP-3 和 DP-3。以 AP-3 和 DP-3 为亲本进行原生质体融合，获得了高产菌株 GR-2，其摇瓶发酵纳他霉素产量达到1.62±0.03g?L?1，是原始菌株的两倍，且菌落更大，菌丝生长能力更强。
2. 发酵动力学差异：对原始菌株 ATCC13326 和高产菌株 GR-2 进行发酵动力学分析，发现发酵前期两者差异不明显，48h 后 GR-2 的葡萄糖消耗速率、生物量增长和纳他霉素产量提升速度加快，96h 时，GR-2 的 DCW 和纳他霉素产量分别比原始菌株高 77.5% 和 102.5%。
3. 高产机制分析：
   • 碳水化合物代谢：GR-2 中糖酵解途径关键酶基因转录水平上调，促进丙酮酸生成，进而增加乙酰辅酶 A（acetyl-CoA）合成；三羧酸循环（TCA cycle）关键酶基因转录水平下调，而戊糖磷酸途径（PPP）关键酶基因转录水平上调，为纳他霉素合成提供了充足的还原力（NADPH）。
   • 分支链氨基酸（BCAAs）代谢：GR-2 中 BCAAs 降解途径相关基因上调，促进乙酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A（malonyl-CoA）合成。添加缬氨酸的实验表明，发酵早期添加缬氨酸可显著提高纳他霉素产量，说明增强细胞内缬氨酸降解途径是 GR-2 高产的关键因素。
   • 氮代谢：GR-2 中氮代谢相关基因上调，提高了氮利用效率，增加了谷氨酸和谷氨酰胺的合成。氨基酸添加实验和基因过表达实验证实，增强氮代谢可促进纳他霉素合成。
   • 磷酸盐代谢：GR-2 中磷酸盐代谢相关的双组分系统（TCS）PhoR 和 PhoP 基因转录水平上调。过表达 PhoR 和 PhoP 可提高纳他霉素产量，而抑制其表达则降低产量，表明 PhoR/PhoP 可能参与纳他霉素生物合成和菌体生理调节。
   • 纳他霉素生物合成途径：GR-2 中纳他霉素生物合成基因簇（BGC）中多数基因转录水平上调，直接促进了纳他霉素的合成。
   
   
4. 强化磷酸盐代谢提升产量：在 GR-2 中过表达 PhoR 和 PhoP，构建重组菌株 GR2-P1、GR2-P2 和 GR2-P3。摇瓶发酵结果显示，GR2-P1 和 GR2-P2 的纳他霉素产量分别比 GR-2 提高 7.93% 和 14.63%。5L 发酵罐中，GR2-P3 发酵 120h 后，DCW 达到28.73g?L?1，纳他霉素产量达到12.2g?L?1 ，为目前报道的生二素链霉菌（Streptomyces gilvosporeus）最高产量。

研究结论表明，GR-2 高产主要归因于纳他霉素生物合成基因簇和前体供应相关基因的上调。增加细胞内缬氨酸和谷氨酸的供应可显著提高纳他霉素产量，且纳他霉素生物合成基因簇可能受 PhoP 和 PhoR 的正调控。该研究为提高纳他霉素产量提供了新策略，明确了关键代谢途径和分子靶点，为优化工业化生产提供了理论依据，也为其他次生代谢产物的合成和调控研究提供了参考。未来，进一步探究氮和磷酸盐代谢在纳他霉素生物合成中的调控机制，通过代谢工程优化这些途径，有望进一步提升纳他霉素产量。