染色体外环状 DNA：结直肠癌早期诊断的新型生物标志物

为解决结直肠癌（CRC）早期检测技术存在的局限性，西安交通大学第一附属医院研究人员开展了 “染色体外环状 DNA（eccDNA）作为结直肠癌进展新型生物标志物” 的研究。结果发现 eccDNA 丰度随 CRC 进展增加，特定基因的 eccDNA 有诊断潜力，该研究为 CRC 早期诊断提供新方向。

　　在人体的 “微观世界” 里，癌症一直是个棘手的难题，结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）更是其中的 “顽固分子”。它在全球范围内发病率和死亡率居高不下，严重威胁着人们的健康。目前，CRC 的早期检测手段存在诸多不足。像结肠镜检查虽有效，却有侵入性，给患者带来痛苦；粪便潜血试验的敏感性和特异性不尽人意；循环肿瘤 DNA（ctDNA）液体活检又受限于血浆中 ctDNA 的低捕获率。其他筛查得到的标志物也存在特异性和敏感性低、无法确定肿瘤组织来源等问题。所以，寻找新型的 CRC 早期诊断生物标志物迫在眉睫。

在这样的背景下，西安交通大学第一附属医院的研究人员开展了一项关于染色体外环状 DNA（Extrachromosomal Circular DNA，eccDNA）作为结直肠癌进展新型生物标志物的研究。该研究成果发表在《Molecular Medicine》杂志上，为 CRC 的早期诊断带来了新的希望。

研究人员在此次研究中主要运用了以下关键技术方法：收集了来自西安交通大学第一附属医院的 CRC 患者的各类组织样本（包括结直肠息肉、腺瘤、肿瘤组织及相邻正常组织）和健康个体的肠上皮组织样本；通过 DNeasy Blood and Tissue kit 提取 DNA，利用 FastDigest MssI 和 Plasmid-Safe ATP-dependent DNase 去除线粒体环状 DNA 和残留线性 DNA，再用 φ29 聚合酶扩增 eccDNA；运用 Circle-Seq 技术对样本进行测序分析，同时采用断点特异性 PCR 验证候选 eccDNA，还利用 RNA 测序（RNA-seq）分析基因表达情况，并构建 AOM/DSS 诱导的结直肠癌小鼠模型进一步验证结果。

下面来看看具体的研究结果：

1. eccDNA 的基因组分布与结直肠癌进展相关：研究人员利用 Circle-Seq 技术检测不同样本中的 eccDNA 水平，发现 eccDNA 的丰度随着 CRC 的进展逐渐增加，在肿瘤组织中最高，且晚期 CRC 样本中的 eccDNA 丰度显著高于早期样本。eccDNA 在大多数常染色体上呈均匀分布，但在 Y 染色体上覆盖度较低。与癌前病变组织相比，肿瘤组织中 eccDNA 在启动子、内含子、外显子、5'^'-UTR 和 3'^'-UTR 区域的水平显著更高。肿瘤组织中 eccDNA 的 GC 含量也明显高于癌前病变组织。
2. 结直肠癌进展过程中 eccDNA 携带基因的变化：通过对 Circle-Seq 数据进行差异分析，研究人员发现与健康个体肠上皮组织相比，癌前组织中有 12,680 个 eccDNA 上调；与癌前组织相比，肿瘤组织中有 456 个 eccDNA 上调，其中 303 个 eccDNA 相关基因在 CRC 进展过程中持续上调。KEGG 通路分析显示，这些 eccDNA 相关基因与肿瘤的发展和转移以及经典信号通路有关。研究人员还通过 PCR 验证了部分高丰度 eccDNA 相关基因的环状结构。
3. 部分 eccDNA 介导的转录调控影响癌基因表达：对肿瘤组织样本进行 RNA 测序，研究人员发现 eccDNA 的总体丰度与基因表达呈正相关。664 个 eccDNA 的丰度与 RNA 转录呈正相关，309 个呈负相关。进一步的通路分析表明，与基因表达负相关的 eccDNA 相关基因富集在胚胎发育等过程；与基因表达正相关的 eccDNA 相关基因富集在胼胝体形态发生等过程。
4. 重复序列有助于 eccDNA 的形成：研究人员对 eccDNA 末端断点上下游序列进行分析，发现癌前和肿瘤组织的 eccDNA 中都存在直接和反向重复序列，且直接重复序列的频率更高。不同类型的 eccDNA（直接重复 eccDNA、反向重复 eccDNA 和无直接重复 eccDNA）在染色体起源和基因组分布上存在差异，反向重复 eccDNA 的环状结构更稳定。
5. eccDNA 对结直肠癌的诊断潜力：研究人员从 303 个持续上调的基因中选取 10 个 eccDNA 丰度最高的基因，构建预测模型。结果显示，随机森林模型的 AUC 达到 0.91，能较好地区分癌前病变和肿瘤。研究人员还验证了这些基因特异性 eccDNA 的环状结构，并通过 AOM/DSS 诱导的小鼠结直肠癌模型进一步证实了 eccDNA 丰度随肿瘤诱导时间延长而增加，表明基因特异性 eccDNA 有作为 CRC 诊断生物标志物的潜力。

研究结论和讨论部分指出，eccDNA 与 CRC 的进展密切相关，其丰度随肿瘤进展而增加，且在息肉、腺瘤和肿瘤组织中的环状大小与正常肠上皮组织不同。部分基因（如 TAFA5、ADA、CRISPLD2）产生的 eccDNA 贯穿 CRC 的发生发展过程，有望作为早期诊断的生物标志物。此外，研究还发现重复序列在 eccDNA 形成中起重要作用，但 eccDNA 的生物学功能仍需进一步研究。虽然 eccDNA 作为肿瘤诊断标志物潜力巨大，但目前其检测和分析技术还不成熟，存在标准化不足、成本高和技术要求高等问题。未来研究需扩大样本量，验证研究结果，并寻找更多肿瘤特异性 eccDNA。总的来说，该研究揭示了 eccDNA 在 CRC 进展中的动态变化，为 CRC 特异性 eccDNA 生物标志物的开发提供了理论基础，对推动 CRC 早期诊断和治疗具有重要意义。