新型工具助力浮霉菌门基因组修饰与异源基因表达：解锁微生物奥秘的新钥匙

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Novel tools for genomic modification and heterologous gene expression in the phylum Planctomycetota

为解决浮霉菌门（Planctomycetota）遗传研究工具匮乏的问题，研究人员开展了关于浮霉菌门基因组修饰和异源基因表达工具的研究。他们建立了两种同源重组方法及鼠李糖诱导表达系统。这为深入研究浮霉菌门的细胞生物学和生物技术应用奠定了基础。

　　在神秘的微生物世界里，浮霉菌门（Planctomycetota）的细菌如同隐藏在深海中的宝藏，充满了独特而迷人的奥秘。它们不仅拥有与众不同的细胞结构，如扩大的周质空间、不对称的细胞分裂（“出芽”）方式，还可能蕴含着尚未被发掘的生物活性小分子，这些特性让它们在生物技术领域具备巨大的应用潜力。然而，长期以来，由于浮霉菌门与常用的模式细菌在系统发育上距离较远，大多数已有的遗传工具对它们并不适用。再加上其生长缓慢、培养条件苛刻、对常见抗生素天然耐药等因素，导致针对浮霉菌门的遗传研究进展缓慢，许多关于它们的细胞生物学机制和代谢途径仍如同迷雾一般，亟待被揭开。

为了打破这一困境，来自德国耶拿弗里德里希?席勒大学（Friedrich Schiller University）的研究人员展开了一项具有开创性的研究。他们致力于开发适用于浮霉菌门的新型遗传工具，期望借此深入探索这些微生物的基因组奥秘，挖掘其潜在的生物技术应用价值。最终，研究成果发表在《Applied Microbiology and Biotechnology》上，为浮霉菌门的研究开辟了新的道路。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是同源重组技术，通过精心设计质粒，实现了对目标基因的精准操作。同时，利用 Illumina 测序和读映射技术，对基因组进行深入分析，确保基因编辑的准确性。此外，荧光显微镜技术和图像分析方法，帮助研究人员直观观察荧光蛋白表达情况，为研究基因表达和细胞定位提供了有力支持 。

研究人员取得了一系列重要的研究结果：

1. 构建单基因缺失突变体：研究人员以预芪烯二磷酸合酶（HpnD）基因为靶点，通过双同源重组策略成功构建了淡水模式物种嗜沼浮霉（Planctopirus limnophila）和海洋物种马略卡施蒂勒菌（Stieleria maiorica）的基因缺失突变体。突变体菌落颜色发生明显变化，表明基因功能被成功敲除，这一结果验证了该基因在类胡萝卜素合成中的关键作用。
2. 多基因座修饰：在嗜沼浮霉中，研究人员发现可以对多达三个基因组位点进行修饰。他们选取了编码 PilQ 样蛋白的基因，构建出三重缺失突变体，且通过检测排除了脱靶效应，为进一步研究基因功能和相互作用提供了有力工具。
3. 荧光蛋白功能验证：通过插入 - 重复诱变策略，研究人员将多种常用的荧光蛋白基因导入嗜沼浮霉基因组，包括 msfTurquoise2ox、mNeonGreen 等。显微镜分析证实这些荧光蛋白在细胞质中均能正确折叠和成熟并发出荧光信号，为后续研究蛋白质功能、定位和相互作用奠定了基础。
4. 构建稳定表达菌株：针对马略卡施蒂勒菌难以处理的问题，研究人员采用改进的双同源基因缺失策略，成功构建了组成型表达 gfpmut2 的菌株，实现了外源基因在该菌株中的稳定表达，为后续相关研究提供了稳定的实验材料。
5. 测试启动子表达强度：研究人员选取了 5 种嗜沼浮霉的天然启动子，与 mNeonGreen 作为报告基因进行组合测试。结果显示，除了 P_tuf启动子未能获得重组菌落外，其他启动子的荧光强度均低于甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶启动子（P_gap），且大多处于空载体对照的自发荧光范围内，表明这些启动子难以有效调节基因表达强度。
6. 开发新型诱导表达系统：常用的诱导表达系统在嗜沼浮霉中均无法发挥作用，研究人员转向对该菌自身调控回路的研究。他们基于鼠李糖 / 岩藻糖分解代谢的 pvm 操纵子，构建了一种新型的鼠李糖依赖的诱导表达系统。实验表明，该系统在添加鼠李糖时能够诱导荧光蛋白基因 msfgfp 的表达，且表达强度受鼠李糖浓度和葡萄糖的影响，展现出良好的诱导特性。

研究结论和讨论部分具有重要意义。研究人员开发的新型分子工具，包括两种同源重组方法和鼠李糖诱导表达系统，为浮霉菌门的遗传研究提供了有力支持。这些工具不仅有助于深入探究浮霉菌门独特的细胞生物学机制，还为挖掘其在生物技术领域的应用潜力提供了可能，例如在生物活性分子生产、生物质转化和生物修复等方面。然而，研究也发现了一些问题，如插入 - 重复诱变效率较低，可能与质粒大小和竞争切除反应有关；构建的鼠李糖诱导表达系统在大肠杆菌中存在非预期的强表达，限制了其应用范围等。未来，研究人员需要进一步优化这些工具，并深入研究浮霉菌门的遗传机制，加强对其代谢途径的探索，以充分发挥浮霉菌门在生命科学和生物技术领域的巨大潜力。