解析孤儿受体 GPR3 寡聚化调控激活与自抑制的结构基础：解锁细胞信号新奥秘

《Cell Reports》：Structural basis of oligomerization-modulated activation and autoinhibition of orphan receptor GPR3

本文通过冷冻电镜技术解析了 G 蛋白偶联受体 3（GPR3）的单体和二聚体结构，发现其寡聚化与独特的自抑制机制相关，且或受脂质调节。这些发现为理解孤儿 GPCRs 的信号转导提供新视角，对设计相关药物及治疗阿尔茨海默病等具有重要意义。

　　### 研究背景
G 蛋白偶联受体 3（GPR3）属于 A 类孤儿受体，与 GPR6、GPR12 在序列上高度同源，且与大麻素受体 CB1 和 CB2 在进化上关系密切。GPR3 在 G_s信号通路中具有高组成性活性，其 mRNA 广泛表达于大脑多个区域，与阿尔茨海默病（AD）的发病相关，还在减数分裂、脂肪细胞产热等生理过程中发挥重要作用。然而，GPR3 高内在活性的机制以及在 cAMP 水平大幅升高时其信号衰减的方式尚不明确，此前虽有关于 GPR3 - G_s复合物的冷冻电镜结构报道，但对其潜在内源性脂质配体的研究存在矛盾，且仅描述了单体形式。

实验方法

1. 蛋白表达与纯化：将 N - Bril 融合的野生型人 GPR3 基因克隆到修饰的 pFastBac1 载体，与显性负性 Gα_s（DNGα_s）和 Gβ₁γ₂共表达于 Sf9 昆虫细胞；Nanobody35（Nb35）克隆到 pET - 15b 载体在大肠杆菌 BL21 中表达并纯化；构建缺失 G 蛋白的 GPR3 表达载体，将其在 Sf9 细胞中表达并纯化。
2. 冷冻电镜样品制备与数据采集：对 GPR3（含或不含 Bril） - DNGs - Nb35 复合物和 GPR3 - 1IU9 复合物分别进行样品玻璃化处理，使用 Titan Krios 显微镜在不同条件下采集冷冻电镜图像。
3. 图像数据处理与模型构建：利用 CryoSPARC 软件对冷冻电镜图像进行处理，包括运动校正、CTF 参数确定、粒子挑选和分类等；以 AlphaFold2 预测的受体结构等为初始模型，在 Chimera、COOT 和 PHENIX 等软件中进行模型构建和优化。
4. 功能实验：采用 NanoBiT 分析检测 GPR3 二聚体相互作用；通过 cAMP 积累分析检测 GPR3 的基础活性和突变体活性；运用生物发光共振能量转移（BRET）分析检测 GPR3 与 G 蛋白的偶联；利用荧光激活细胞分选（FACS）分析检测细胞表面受体表达。

实验结果

1. GPR3 - G_s复合物的结构：通过冷冻电镜单颗粒分析，获得了单体 GPR3 - G_s - Nb35 复合物（GPR3_mon - G_s复合物）和二聚体 GPR3 - G_s - Nb35 复合物（GPR3_dim - G_s复合物）的结构，分辨率分别为 3.16 ? 和 3.06 ?。在 GPR3 同二聚体中，只有一个异源三聚体 G 蛋白与一个受体结合。尺寸排阻色谱分析和 NanoBiT 分析证实了 GPR3 单体和二聚体在细胞中的共存。
2. 无 G 蛋白时 GPR3 二聚体的结构：为研究 GPR3 寡聚化与 G_s偶联的关系，制备了无 G 蛋白的 GPR3 二聚体结构（1IU9 - GPR3_dim），分辨率为 3.6 ?。该结构中受体的 EM 密度图清晰，融合蛋白 1IU9 分辨率较低，表明 ICL3 区域具有动态性。
3. 不同寡聚态 GPR3 的结构特征：GPR3_mon - G_s复合物与 B - GPR3_dim - G_s复合物的几何结构高度相似，但 GPR3_dim - G_s复合物中两个受体在 TM5、TM6、ICL2 和 ICL3 区域的细胞质端存在显著差异。A - GPR3_dim - G_s中 ICL3 弯曲延伸到细胞内凹槽，可能阻碍 Gα_s的 α5 螺旋结合，从而产生自抑制作用。B - GPR3_dim - G_s和 GPR3_mon - G_s具有典型的 G_s偶联 A 类 GPCR 结构特征，ECL2 通过二硫键稳定构象，N 端对受体自激活作用不大。1IU9 - GPR3_dim中的受体处于类似活性状态。
4. GPR3 的潜在内源性激动剂：GPR3 正交口袋中的额外密度表明其可能被内源性配体激活。对接结果显示，油酸（OA）和油酰乙醇酰胺（OEA）可能结合在 GPR3 的正交口袋中，但需要进一步实验验证其功能。
5. GPR3 的二聚体界面：GPR3_dim - G_s复合物的二聚体界面主要由 TM5、TM6 的细胞外端和 TM3 的细胞内端组成，界面面积约 1285 ?²，大于 APJR 的二聚体界面。该界面通过氢键、疏水和极性相互作用稳定，对界面关键残基的突变研究表明，破坏二聚化可增强信号传导。
6. GPR3 与 G_s的界面：GPR3 与 G_s的界面由 GPR3 的 TM3、TM5、TM6 和 TM7 的细胞质部分以及 Gα_s的 Ras 样 GTP 酶结构域组成。受体细胞质端与 Gα_s的 α5 螺旋通过疏水和极性相互作用形成深腔，BRET 分析表明 GPR3 与 G_s蛋白偶联时具有高基础活性，与 G_i1蛋白偶联时则无。
7. GPR3 的激活：GPR3 在无外源激动剂时具有高组成性活性，其激活不依赖 N 端和 ECL 环，脂质可能是其组成性活性的潜在调节因子。通过比较不同状态下 GPR3 的结构，发现其保守基序与激活的 A 类 GPCR 相似，关键残基突变会降低其组成性活性。
8. GPR3_dim - G_s结构中 A - GPR3_dim的抑制：GPR3_dim - G_s复合物中 A - GPR3_dim的 ICL3 弯曲和 ICL2 构象变化可能阻碍 G 蛋白偶联，相关关键残基突变可增加 cAMP 产生，缓解自抑制。

讨论

本研究揭示了 GPR3 独特的二聚化和自抑制特征。首次证明 GPR3 存在单体和二聚体状态，二聚体界面主要由 TM5 介导，是 A 类 GPCR 中较为广泛和稳定的界面之一。ICL3 的弯曲及其与 ICL2 的构象变化在调节 G 蛋白结合中起重要作用，脂质可能参与调节 GPR3 活性。这些发现为理解 A 类 GPCR 的二聚化调节激活和细胞内环的自调节机制提供了新视角，为设计 GPR3 配体和调节其他信号通路（如 β - arrestin）提供了结构基础，对治疗 AD 和肥胖等疾病的靶向治疗策略具有潜在意义。

研究局限性

尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些局限性。ICL3 介导的自抑制与受体二聚化之间的关系尚未完全明确，观察到的脂质密度的身份和功能作用也未完全确定。未来需要进一步研究 ICL3 弯曲的动态过程，以及二聚化和脂质相互作用在调节 GPR3 信号传导中的生理作用。