肌肉特异性雷诺丁受体 1 特性：肢带型肌营养不良 2B/R2 进展的关键因素

《Nature Communications》：Muscle-specific Ryanodine receptor 1 properties underlie limb-girdle muscular dystrophy 2B/R2 progression

为探究雷诺丁受体 1（RyR1）功能与肢带型肌营养不良 2B/R2（LGMD2B/R2）预后的关联，研究人员对比小鼠不同病理程度肌肉的 Ca2+处理特性和蛋白质组学特征。结果发现，RyR1 Ca2+泄漏加剧会导致疾病进展。这为理解 LGMD2B/R2 发病机制提供了新视角。

　　在人体的肌肉世界里，有一种神秘的疾病 —— 肢带型肌营养不良 2B/R2（LGMD2B/R2）。它由 dysferlin 蛋白缺乏引起，就像给肌肉健康埋下了一颗定时炸弹，随着年龄增长，会选择性地攻击特定肌肉群。患者的部分肌肉会逐渐萎缩、无力，严重影响生活质量。但令人困惑的是，不同肌肉受影响的程度差异很大，背后的原因却一直是个谜。同时，雷诺丁受体 1（Ryanodine receptor 1，RyR1）在肌肉生理中起着关键作用，其 Ca²⁺泄漏与多种肌肉疾病相关。然而，在 LGMD2B/R2 中，RyR1 Ca²⁺泄漏在疾病严重程度不同的肌肉中的作用尚不明确。为了解开这些谜团，来自澳大利亚昆士兰大学等机构的研究人员开展了深入研究。

研究人员通过一系列实验，对比了小鼠中受影响严重的腰大肌（psoas）和受影响较轻的胫骨前肌（tibialis anterior，TA）、趾长伸肌（extensor digitorum longus，EDL）的 Ca²⁺处理特性和蛋白质组学特征。他们发现，健康小鼠的腰大肌与 TA/EDL 相比，具有更高的 RyR1 Ca²⁺泄漏、基础 RyR1 磷酸化水平，且纤维 Ca²⁺分布不同，线粒体 Ca²⁺含量更高。这表明不同肌肉在基础状态下的 RyR1 功能和 Ca²⁺处理存在差异。

在 dysferlin 基因敲除小鼠模型（BlaJ 小鼠）中，研究人员进一步发现，缺乏 dysferlin 会破坏二氢吡啶受体（dihydropyridine receptor，DHPR）对 RyR1 泄漏的抑制控制，使得腰大肌中已磷酸化的 RyR1 通道泄漏加剧，但 TA 中未出现这种情况。这说明 dysferlin 的缺失对不同肌肉中 RyR1 泄漏的影响具有特异性。

研究还发现，腰大肌呈现出独特的产热程序。与 TA 相比，腰大肌具有更高的交感神经输入、基础 PKA 信号传导和更高的产热能力，这与其中较高的 RyR1 Ca²⁺泄漏和线粒体 Ca²⁺含量相呼应。

随着年龄增长，dysferlin 基因敲除小鼠腰大肌中氧化应激增加，导致 t 系统 Ca²⁺处理蛋白氧化，进而影响 Ca²⁺通量和储存操纵性 Ca²⁺进入（store-operated Ca²⁺ entry，SOCE）机制。这使得腰大肌的 Ca²⁺处理功能受损，进一步加剧了疾病的进展。

总的来说，该研究揭示了肌肉特异性的 RyR1 特性在 LGMD2B/R2 疾病进展中的重要作用。这为理解 LGMD2B/R2 的发病机制提供了新的视角，也为未来开发针对该疾病的治疗策略提供了潜在的靶点。该研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员在实验中主要运用了以下关键技术方法：首先，通过对小鼠肌肉组织进行 Hematoxylin and Eosin 染色，观察肌肉病理变化；其次，利用蛋白质组学分析技术，包括 Filter aided sample preparation（FASP）、Data dependent acquisition（DDA）、SWATH 等，研究肌肉蛋白质表达差异；最后，运用共聚焦显微镜成像技术结合特定荧光染料，如 rhod-5N，测量 RyR1 Ca²⁺泄漏和 t 系统 Ca²⁺处理情况 。

研究结果如下：

1. 健康肌肉间 RyR1 Ca²⁺泄漏的固有差异在 dysferlin 缺失时加剧：研究人员选择腰大肌作为严重营养不良表现的代表肌肉，TA 和 EDL 作为轻度营养不良表现的代表肌肉。通过测量 8 周龄小鼠腰大肌和 TA 纤维的 RyR1 泄漏情况，发现野生型（WT）腰大肌的 RyR1 泄漏高于 WT TA，且在 BlaJ 小鼠中，腰大肌的 RyR1 泄漏进一步加剧，但 TA 组间无差异。此外，WT 腰大肌的基础 RyR1 磷酸化水平更高，这可能是导致其 RyR1 泄漏增加的原因之一。
2. RyR1 Ca²⁺泄漏协同增加：研究发现，缺乏 dysferlin 会通过 DHPR 失稳和 RyR1 磷酸化协同增加 RyR1 泄漏。nifedipine 对 BlaJ 纤维中 RyR1 泄漏的抑制作用明显强于 WT 纤维，表明 dysferlin 缺失影响了 DHPR 与 RyR1 的相互作用。同时，通过实验证实，增加的 RyR1 泄漏是由 DHPR - RyR1 相互作用异常引起，而非 RyR1 通道的内在特性。
3. RyR1 Ca²⁺泄漏协调纤维 Ca²⁺分布：由于 WT 腰大肌和 TA 的 RyR1 Ca²⁺泄漏存在差异，且 BlaJ 腰大肌的 RyR1 泄漏加剧，研究人员对不同组别的肌肉纤维进行了 Ca²⁺含量和分布评估。结果显示，WT 腰大肌的 SR Ca²⁺含量低于 WT TA，而线粒体 Ca²⁺含量更高。在 BlaJ 小鼠中，腰大肌的 SR Ca²⁺含量进一步降低，线粒体 Ca²⁺含量增加，表明 RyR1 Ca²⁺泄漏会导致细胞内 Ca²⁺分布改变。
4. 小鼠腰大肌的产热特化：与 TA 相比，WT 腰大肌具有更高的基础 PKA 信号传导、去甲肾上腺素浓度和产热相关蛋白表达。蛋白质组学分析和基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析表明，腰大肌在产热和代谢方面具有独特的功能，这与其中较高的 RyR1 Ca²⁺泄漏和线粒体 Ca²⁺含量相关，说明腰大肌具有更强的产热能力。
5. 氧化应激导致 t 系统 Ca²⁺处理功能受损：在 dysferlin 基因敲除小鼠的腰大肌中，氧化应激会导致 t 系统 Ca²⁺处理蛋白氧化，进而影响 Ca²⁺通量和 SOCE 机制。实验表明，BlaJ 腰大肌纤维的 Ca²⁺挤出和 SOCE 速率较慢，而抗氧化剂 N - acetylcysteine（NAC）可以恢复这些功能，说明氧化应激是导致 t 系统 Ca²⁺处理功能受损的重要原因。
6. 氧化促进 LGMD2B/R2 的年龄依赖性进展：随着年龄增长，BlaJ 腰大肌的病理逐渐加重。研究发现，36 周龄的 BlaJ 腰大肌纤维中，RyR1 泄漏加剧，导致慢性低电导 SOCE 激活。同时，氧化作用使得 RyR1 泄漏进一步增加，细胞内 Ca²⁺分布进一步改变，SR Ca²⁺含量降低，这些变化都促进了疾病的进展。

研究结论和讨论部分指出，健康肌肉中 RyR1 Ca²⁺泄漏的差异与其产热能力相关，而 dysferlin 基因敲除小鼠腰大肌中磷酸化且泄漏的 RyR1 会导致疾病相关变化，如 RyR1 泄漏加剧、t 系统 Ca²⁺通透性改变、SR Ca²⁺耗竭以及细胞质和线粒体 Ca²⁺积累等，这些变化在疾病表型出现之前就已发生。研究还强调了氧化应激在疾病进展中的重要作用，它不仅影响 t 系统 Ca²⁺处理蛋白的功能，还导致 SOCE 激活延迟。此外，研究人员还讨论了 t 系统膜脂质组成、机械应力等因素对疾病的影响。该研究为深入理解 LGMD2B/R2 的发病机制提供了重要依据，为未来的治疗研究指明了方向，具有重要的理论和临床意义。