β-胡萝卜素通过不对称协同作用缓解糖基转移酶NbUGT72AY1的底物抑制机制

《Nature Communications》：

编辑推荐：本研究针对植物糖基转移酶NbUGT72AY1的底物抑制（SI）现象，通过结构生物学与动力学分析揭示了β-胡萝卜素作为竞争性抑制剂却能逆转SI的分子机制，提出“不对称协同性”新范式，为代谢调控和工业酶工程提供了新思路。论文发表于《Nature Communications》。

　　 在生物催化领域，底物抑制（Substrate Inhibition, SI）是困扰20%以上酶功能的普遍现象，传统理论认为其源于非生产性酶-底物复合物的形成，但缺乏结构证据。烟草糖基转移酶NbUGT72AY1在植物防御中催化酚类物质的葡萄糖基化，表现出强烈的SI效应，而令人意外的是，竞争性抑制剂β-胡萝卜素竟能显著缓解这种抑制。这一反常现象为揭示SI的分子机制提供了独特契机。

为了解析这一矛盾现象，德国慕尼黑工业大学等机构的研究团队通过X射线晶体学、氢氘交换质谱（HDX-MS）和分子动力学（MD）模拟等技术，捕获了NbUGT72AY1在活性与非活性状态下的构象变化。研究发现，底物随机结合但需特定顺序完成反应的“不对称协同性”机制是SI的核心成因：高浓度底物优先形成非生产性三元复合物，而β-胡萝卜素通过动态调控蛋白构象（如破坏Trp350与UDPG的π-π堆叠）重定向反应路径。该成果不仅首次提供SI的结构证据，还提出“竞争性抑制剂激活酶活性”的新范式，为设计抗SI工业酶和代谢工程奠定基础。

关键技术方法：

1. ?X射线晶体学：解析apo酶、底物/效应剂复合物等9种结构，分辨率达3.1 ?；
2. ?氢氘交换质谱（HDX-MS）?：追踪β-胡萝卜素与底物结合引起的蛋白动态变化；
3. ?分子动力学模拟：分析Trp350构象对催化活性的影响；
4. ?转基因烟草模型：验证β-胡萝卜素过表达植株中糖苷产物scopolin的积累增强。

研究结果： 1. 胡萝卜素与叶黄素作为效应剂的差异作用 β-胡萝卜素和其衍生物（如β-apo-8'-胡萝卜醛）在200 μM时完全消除SI，而羟基化叶黄素（如玉米黄质）则表现为抑制剂。这种差异源于疏水相互作用与极性基团的竞争：β-胡萝卜素通过疏水核心动态化“闭合环”（Ser309-Asp327），而叶黄素的羟基与His139形成氢键阻碍催化。

2. 底物抑制与产物抑制的结构基础 晶体结构显示，SI复合物（PDB: 9J9K）与产物抑制复合物（PDB: 8J2U）均具有闭合活性中心，但前者结合UDPG而非UDP。关键残基Trp350的取向决定催化效率——其吲哚环在活性构象中远离His18，而在非活性态与UDPG堆叠。

3. 不对称协同性模型 动力学分析表明，Scopoletin与UDPG的结合存在路径依赖性：当UDPG先结合时形成活性复合物（Hill系数h=1），而Scopoletin优先结合则导致SI（h>1）。数学建模推导的速率方程（含双Hill系数）完美拟合实验数据，证实“随机结合但有序反应”的机制。

4. 植物体内验证 β-胡萝卜素过表达烟草经2,4-D诱导后，scopolin产量较野生型提高10倍（5.9 vs. 0.2 μg/g鲜重），印证效应剂在自然系统中的调控功能。

结论与意义： 该研究颠覆了传统SI理论，提出“不对称协同性”作为双底物酶调控的普适机制：

• ?理论层面：阐明竞争性抑制剂可通过构象选择逆转SI，拓展了Allostery（别构调控）的定义；
• ?应用价值：为设计抗SI的工业酶（如药物糖基化酶）提供新策略，如靶向Trp350或疏水口袋的工程改造；
• ?生理启示：揭示植物通过次级代谢物（如类胡萝卜素）动态平衡防御代谢流的新机制。 论文以结构生物学为基石，整合多学科方法，为酶动力学与代谢调控研究树立了范式。