Gilteritinib：靶向 AXL，开启实体肿瘤治疗新征程

《Cell Death Discovery》：Antitumor activity of gilteritinib, an inhibitor of AXL, in human solid tumors

癌症严重威胁全球健康，胃癌（GC）、食管癌（EC）、卵巢癌（OC）预后差。AXL 作为潜在抗癌靶点，其抑制剂 gilteritinib 在实体肿瘤中的作用不明。研究人员探究其在 AXL 阳性的 EC、OC、GC 中的疗效，发现 gilteritinib 显著抑制肿瘤细胞生长、转移，为临床治疗提供新方向。

　　在全球范围内，癌症始终是严重威胁人类健康的重大公共卫生问题。许多癌症在早期阶段往往没有明显症状，等到确诊时常常已经发展到晚期或出现转移，这使得找到最有效的治疗方法变得极为困难。就拿胃癌（GC）来说，它是全球第五大常见恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第四大原因，晚期胃癌患者的 5 年生存率仅为 17.8%。食管癌（EC）同样不容小觑，是全球第六大癌症相关死亡原因，晚期食管癌患者的 5 年生存率只有 20%。卵巢癌（OC）作为女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，晚期患者的 5 年生存率也仅有 49.1% 。这些数据都表明，开发针对实体肿瘤的新治疗策略迫在眉睫。

AXL，作为受体酪氨酸激酶 TAM 家族（Tyro3、Axl、Mer）的重要成员，在多种恶性肿瘤中异常过表达，其中就包括 EC、GC 和 OC。它就像肿瘤生长、转移过程中的 “帮凶”，通过激活 PI3K/AKT 和（或）MAPK/ERK 等信号通路，促进肿瘤细胞的生长、分化、增殖和转移。不仅如此，AXL 的过表达或激活还与肿瘤的转移、耐药以及不良预后密切相关，因此，抑制 AXL 成为了开发靶向抗癌药物的热门策略。

Gilteritinib 是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的口服小分子抑制剂，主要用于治疗 FLT3 突变的急性髓系白血病（AML）。它除了能抑制 FLT3，还能抑制在 AML 中频繁过表达的 AXL，是一种双靶点抑制剂，目前在 AML 治疗领域已取得了不错的临床效果。然而，gilteritinib 在实体肿瘤中的抗肿瘤活性却鲜为人知。

为了深入探究 gilteritinib 在实体肿瘤中的作用，赣南医学院的研究人员开展了一系列研究。他们将研究重点聚焦在 AXL 阳性的 EC、OC 和 GC 上，旨在明确 gilteritinib 对这些肿瘤的治疗效果以及相关的分子机制。经过一系列严谨的实验研究，他们发现 gilteritinib 在体外、体内和临床前模型中都展现出了显著的抗肿瘤活性，这一成果为实体肿瘤的治疗带来了新的希望。该研究成果发表在《Cell Death Discovery》杂志上。

研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，采用细胞活力检测（Cell Titer-Glo? luminescent cell viability assay）、EdU 染色、克隆形成实验等检测细胞增殖；通过 Annexin V-FITC 凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒分析细胞凋亡和细胞周期；利用 Transwell 实验评估细胞迁移和侵袭能力。在分子水平，进行 RNA 测序（RNA-Seq）分析基因表达变化，运用蛋白质免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达和磷酸化水平。此外，还构建了患者来源的异种移植（PDX）模型、患者来源的类器官（PDO）模型和 PDX 肿瘤来源的类器官（PDXO）模型，结合免疫组化（IHC）染色等技术，从多个角度深入探究 gilteritinib 的作用机制和治疗效果。

研究结果如下：

1. Gilteritinib 显著抑制 AXL 阳性实体肿瘤细胞活力：研究人员首先检测了多种肿瘤细胞系中 AXL 的表达情况，发现 TE-1、KYSE30 和 A2780 细胞中 AXL 表达较高，MKN45 细胞中表达相对较低。随后通过细胞活力检测实验表明，gilteritinib 能以剂量和时间依赖的方式显著抑制 KYSE30、TE-1、A2780、SK-OV-3、HGC-27 和 MKN45 等细胞的生长，这充分显示出 gilteritinib 在 AXL 阳性肿瘤中具有强大的抗肿瘤潜力。
2. Gilteritinib 显著抑制细胞增殖和体外成球能力：EdU 染色和克隆形成实验结果显示，gilteritinib 剂量依赖性地抑制 KYSE30、A2780 和 HGC-27 细胞的增殖。此外，在细胞成球实验中，随着 gilteritinib 浓度的增加，KYSE30、A2780 和 HGC-27 细胞形成的球状体数量和大小显著减少，细胞活力也明显降低，这表明 gilteritinib 能够有效抑制癌细胞的增殖和自我更新能力。
3. Gilteritinib 显著诱导 EC、OC 和 GC 细胞周期阻滞：经 gilteritinib 处理 24 小时后，KYSE30、A2780 和 HGC-27 细胞的存活率明显下降，且呈剂量依赖性。Annexin V-AAD 染色结果显示，gilteritinib 显著诱导这些细胞发生凋亡。同时，在 KYSE30 和 A2780 细胞中，gilteritinib 诱导了细胞周期阻滞，表现为 G0 - G1 期细胞减少，G2 - M 期细胞增多，这揭示了 gilteritinib 通过诱导凋亡和细胞周期阻滞发挥抗肿瘤作用的机制。
4. Gilteritinib 主要抑制 EC、OC 和 GC 细胞的运动能力：Transwell 实验结果表明，与未处理组相比，gilteritinib 剂量依赖性地抑制 KYSE30、A2780 和 HGC-27 细胞的迁移和侵袭能力，这充分说明 gilteritinib 能够显著抑制 AXL 阳性的 EC、OC 和 GC 细胞的转移能力，对于控制肿瘤的扩散具有重要意义。
5. Gilteritinib 对 EC、OC 和 GC 细胞全局基因表达谱的影响：对经 gilteritinib 处理的 KYSE30、A2780 和 HGC-27 细胞进行 RNA-Seq 分析，发现大量基因的表达发生了显著变化。京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析显示，gilteritinib 主要调节与细胞凋亡、细胞周期、mTOR 通路、AMPK 通路、p53 通路、FOXO 通路、Hippo 通路和 Wnt 通路等相关的信号通路，这些通路对于癌细胞的增殖和转移至关重要。同时，蛋白质免疫印迹实验也验证了 gilteritinib 对相关信号通路的抑制作用，进一步证实了其抗肿瘤的分子机制。
6. Gilteritinib 治疗影响其他通路并下调与 EC、OC 和 GC 相关的独特预后基因：基因集富集分析（GSEA）显示，gilteritinib 处理后，在 KYSE30、A2780 和 HGC-27 细胞中，与胆固醇稳态相关的基因集呈强正富集，而与细胞周期进展和增殖相关的基因集（如 hallmark_E2F_targets 和 hallmark_MYC_targets_V1）呈强负富集。通过对癌症基因组图谱（TCGA）数据集的分析发现，gilteritinib 下调的部分基因（如 CENPE、MCM4 等）在 EC、OC 和 GC 患者中高表达，且与不良预后相关，这表明 gilteritinib 可能通过调节这些基因发挥抗肿瘤作用。
7. Gilteritinib 在组织培养药物敏感性试验（HDST）中有效诱导 EC、OC 和 GC 细胞死亡：研究人员利用水凝胶包埋的 HDST 分析方法，对来自 PDX 小鼠的临床相关人 PDXEs 进行研究。结果显示，AXL 在人 GC、OC 和 EC 的 PDXEs 中均有表达，且 gilteritinib 能够显著诱导 AXL 阳性的 EC、OC 和 GC PDEX 细胞死亡，这为 gilteritinib 在临床治疗中的应用提供了有力的证据。
8. Gilteritinib 显著抑制晚期 EC PDXO 生长：研究人员建立了 EC PDXO 模型，通过免疫组化检测发现 AXL 在 PDXOs 及其相应的 PDX 组织中均过表达且亚细胞定位相似。利用 IncuCyte? S3 活细胞成像系统分析发现，gilteritinib 在 0 - 144 小时内，以剂量和时间依赖的方式抑制 EC241 和 EC291 PDXOs 的生长，这表明 gilteritinib 在 PDXOs 中具有协同抗肿瘤作用，为临床前药物开发提供了重要参考。
9. Gilteritinib 显著提高晚期 EC PDX 模型的抗肿瘤活性：在 EC241 和 EC291 PDX 模型中，gilteritinib 均显示出剂量依赖性的抗肿瘤作用。虽然部分差异在统计学上不显著，但 50mg/kg 的 gilteritinib 在两个模型中都显著抑制了肿瘤生长，且治疗组小鼠体重无明显变化，重要器官也未出现明显毒副作用，这表明 gilteritinib 在体内具有良好的耐受性和抗肿瘤效果，为其临床应用奠定了基础。

研究结论和讨论部分指出，AXL 作为一个有前景的治疗靶点，其抑制剂的抗肿瘤效果和作用机制有待深入研究。本研究首次在人实体肿瘤细胞系和 PDX 组织中对 gilteritinib 进行了全面研究，证实了 gilteritinib 在体外、体内和临床前模型中均具有显著的抗肿瘤活性。它通过下调多个与癌症相关的通路，包括细胞凋亡、细胞周期、mTOR 通路、AMPK 通路、p53 通路和 FOXO 通路等，发挥强大的抗肿瘤作用。此外，研究还发现了一些与不良预后相关的基因，为进一步理解 gilteritinib 的作用机制提供了新的视角。这些研究结果为 gilteritinib 在 AXL 阳性实体肿瘤的临床治疗开发提供了坚实的理论依据，有望为癌症患者带来新的治疗选择，改善患者的预后和生存质量。