瘤胃微生物群通过激活 PPARγ 转录因子调控西藏羊肌内脂肪沉积：瘤胃 - 肌肉轴视角下的肉类风味奥秘

《mSystems 5.0》：Rumen microbiota regulates IMF deposition in Xizang sheep by activating the PPARγ transcription factor: a rumen-muscle axis perspective

本文通过多组学方法研究西藏羊，发现瘤胃微生物群经瘤胃 - 肌肉轴，在溶质载体家族基因（SLC）调控下，使短链脂肪酸（SCFAs）激活过氧化物酶体增殖物激活受体 γ（PPARγ），调节脂质代谢基因表达，影响肌内脂肪（IMF）沉积与肉品风味，为改善反刍动物肉品风味提供新思路。

　　### 研究背景
随着人们生活质量需求的提升，消费者对动物源性食品的风味愈发关注。西藏羊作为高原地区主要的动物源性食品，探究其风味的调控机制意义重大。过往研究表明，脂肪酸和氨基酸在肉类风味中起关键作用，且饮食营养成分会影响羊的脂肪酸代谢。同时，肠道 - 肌肉轴在脂肪代谢中的作用逐渐被揭示，但瘤胃 - 肌肉轴对脂肪代谢及肉类风味的影响研究尚少。鉴于瘤胃及其微生物群在反刍动物消化系统中的重要性，本研究聚焦西藏羊，旨在揭示瘤胃 - 肌肉轴与西藏羊肉风味之间的联系。

材料与方法

1. 实验设计与采样：2023 年 6 月至 11 月，在中国西藏班戈县马前村，选取平均年龄 1 岁、体重相近的健康西藏羊，分为夏季组（SUM，n = 6）和秋季组（AUT，n = 6），在海拔约 4750 米的天然草原放牧。实验结束时，禁食 12 小时后屠宰绵羊，采集瘤胃液和背最长肌（LD），液氮保存后置于 - 80°C 冰箱待测。
2. 瘤胃 SCFAs 测定：称取 1 克 4°C 冷冻瘤胃液样本，加入 2 mL 0.1% 盐酸，冰浴 25 分钟，15000 rpm、4°C 离心 15 分钟，取上清液过滤后用气相色谱仪测定乙酸、丙酸、丁酸等 SCFAs 浓度。
3. RNA 提取、cDNA 合成及实时定量 PCR：按标准协议处理瘤胃和肌肉样本，用 RNAiso Plus 试剂提取总 RNA，经反转录合成 cDNA，使用 TB Green Premix Ex Taq^TM II 和 CFX96 实时 PCR 检测系统进行实时定量 PCR（qPCR），采用 2^-ΔΔCt方法评估基因相对表达量。
4. RNA 测序与分析：利用 Illumina NovaSeq 6000 平台进行 RNA 测序，以绵羊参考基因组为对照过滤原始数据，用 Hisat2 比对测序数据，DESeq 分析差异表达基因（DEGs），FeatureCounts 定量基因读数，通过 Benjamini - Hochberg 方法校正 P 值确定错误发现率（FDR），以 | log2Fold Change| ≥ 1 和 FDR < 0.05 为标准筛选 DEGs，借助 Metware Cloud 平台进行数据分析并绘制热图、火山图，开展基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。
5. DNA 提取：采用 CTAB 法提取瘤胃液样本全基因组 DNA，1% 琼脂糖凝胶检测 DNA 浓度和纯度，稀释至 1 ng/μL 后进行后续分析。
6. 16S rDNA 扩增子测序与分析：对绵羊瘤胃液 DNA 的 16S rDNA 扩增子进行测序，拼接过滤原始数据得到 clean data，Deblur 去噪生成扩增子序列变体（ASVs），Mothur 注释 ASV 序列，分析不同水平（门、纲、目、科、属、种）的分类数据和群落组成，通过计算香农（Shannon）、辛普森（Simpson）等 α 多样性指标评估样本物种丰富度和均匀度，基于加权 UniFrac 距离采用主坐标分析（PCoA）等方法分析组间 β 多样性，用 t 检验和 Wilcoxon 检验比较两组微生物组成和群落结构差异，计算 Spearman 相关系数评估细菌与 DEGs、氨基酸和脂肪酸之间的关联。
7. 靶向代谢脂肪酸提取与分析：取 - 80°C 超低温冰箱中的 LD 肌肉样本进行代谢物提取，经研磨、加试剂、涡旋、离心、氮吹、衍生化等一系列操作后，取正己烷层溶液用于气相色谱分析。
8. 靶向代谢氨基酸提取与分析：称取夏季和秋季 LD 样本各 50 毫克，加入预冷的 70% 甲醇水溶液，涡旋、离心后取上清液，经处理后用液相色谱 - 串联质谱进行分析。
9. 统计分析：使用 SPSS 21.0 软件进行统计分析，GraphPad Prism 9.0 软件绘制柱状图，两组间比较采用 Student’s t 检验，P < 0.05 为差异有统计学意义，P < 0.01 为差异高度显著。
10. 共发生网络分析：选取属水平上有显著差异的微生物群、显著的 DEGs 以及氨基酸和脂肪酸构建共发生网络，用 Python 软件计算 Spearman 相关系数，Cytoscape 3.0.1 软件可视化相关性（|rho| > 0.70）。

研究结果

1. 西藏羊体重变化分析：两组西藏羊初始体重、最终体重和平均日增重无显著差异，但 SUM 组最终体重和平均日增重有增加趋势。
2. 瘤胃 SCFA 分析：SUM 组瘤胃液中乙酸浓度显著高于 AUT 组，总 SCFA（T - SCFA）浓度也更高，其他几种 SCFAs 浓度两组间无显著差异，表明西藏羊在夏季能储存更多能量。
3. 瘤胃微生物群组成分析：两组瘤胃微生物群的 Chao1、Shannon 和 ACE 指数无显著差异，表明秋季和夏季瘤胃微生物群多样性和丰度相似。共发现 1351 个 ASVs，SUM 组和 AUT 组分别鉴定出 572 个和 578 个。PCoA 分析显示两组分离。在门水平上，Firmicutes 和 Bacteroidota 占主导；在属水平上，Prevotella 和 unidentified Bacteroides 占优势。进一步筛选发现，SUM 组有 9 种微生物相对丰度显著上调，AUT 组有 2 种微生物相对丰度显著增加，在种水平上也有相应差异。
4. AUT 和 SUM 瘤胃中 DEGs 鉴定：RNA - seq 分析发现，两组瘤胃上皮组织共有 2214 个 DEGs，其中 1269 个显著上调，945 个显著下调。聚类分析表明季节对瘤胃基因转录表达有独特影响，qPCR 验证了部分基因 mRNA 水平变化与 RNA - seq 结果相符。
5. DEGs 功能分析：GO 富集分析显示，DEGs 主要富集在生物调节、结合等功能类别；KEGG 通路分析表明，主要富集在癌症相关通路、运动蛋白、细胞黏附分子等通路，其中运动蛋白和细胞黏附分子间接影响瘤胃营养物质摄取。
6. 瘤胃上皮 SLC 基因表达与功能分析：筛选出 38 个 SLC 基因，发现瘤胃 SLC 基因表达具有季节特异性，17 个上调，21 个下调。KEGG 富集分析显示，DEGs 在矿物质吸收通路最为集中，且这些基因之间存在复杂关联。
7. 肌球蛋白重链基因和脂质代谢相关基因表达分析：SUM 组 LD 肌球蛋白重链 2 基因（MYH2）显著上调，AUT 组肌球蛋白重链 7 基因（MYH7）显著上调。在脂质代谢相关基因方面，SUM 组 CPT2、PNPLA2、FAS、PPARγ 和 SCD1 基因表达显著高于 AUT 组，而 AUT 组 UCP2 基因表达显著更高。
8. 肌肉脂肪酸组成：SUM 组肌肉中 C16:1、C18:1n9t、C20:5n3、C22:6n3 和 C20:3n6 浓度显著高于 AUT 组，SUM 组单不饱和脂肪酸（MUFA）含量显著更高，两组饱和脂肪酸（SFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）浓度无显著差异，但 SUM 组 PUFA 浓度有上升趋势，表明夏季西藏羊肌肉脂肪酸谱优于秋季。
9. 肌肉氨基酸组成：两组在必需氨基酸（EAA）、支链氨基酸（BCAA）、风味氨基酸（FAA）、非必需氨基酸（NEAA）和总氨基酸（TAA）浓度上无明显差异，但 SUM 组肌肉中谷胱甘肽氧化型、N - 异戊酰甘氨酸、N - 丙酰甘氨酸和 γ - 氨基丁酸等非标准氨基酸浓度显著高于 AUT 组。
10. 相关性分析：瘤胃微生物群与基因、肌肉脂肪酸和氨基酸存在复杂相关性。如 Pseudobutyrivibrio 和 unidentified_Christensenellaceae 与部分 SLC 基因呈显著正相关或负相关；Howardella 与部分脂肪酸呈负相关；Pseudobutyrivibrio、Mailhella 和 Treponema 与 Glu 呈负相关等。

讨论

本研究发现不同肌肉脂肪酸含量的西藏羊瘤胃细菌群落组成不同，这些差异细菌群落产生的 SCFAs 在 SLC 家族基因调控下被瘤胃上皮吸收，经循环系统到达肌肉组织调节 IMF 沉积，进而影响羊肉风味，初步证明瘤胃微生物群与西藏羊肉风味直接相关。
瘤胃细菌在降解纤维素等物质过程中发挥重要作用，Firmicutes 和 Bacteroidetes 是瘤胃中最主要的细菌，Firmicutes 与脂肪沉积有关，其与 Bacteroidetes 的比例影响 SCFAs 水平和脂肪沉积程度。夏季西藏羊瘤胃中 Firmicutes 与 Bacteroidota 比例及 T - SCFAs 水平更高。瘤胃中多种细菌参与脂肪代谢，影响不饱和脂肪酸（UFA）组成，本研究中 SUM 组部分与脂肪代谢相关细菌相对丰度更高，利于促进 UFA 氢化。
瘤胃细菌代谢产生的 SCFAs 对宿主能量代谢和脂肪沉积至关重要。通过比较两组西藏羊瘤胃上皮组织转录组，发现多个与 SCFA 吸收相关的 DEGs，不同 SLC 基因在两组中的表达变化不同，推测与瘤胃 SCFAs 浓度变化有关，SCFAs 经 SLC 家族基因调控被瘤胃壁吸收，参与肌肉 IMF 合成，影响羊肉风味。
肌肉中脂肪酸组成受相关基因表达调控，本研究表明夏季西藏羊瘤胃微生物群产生的 SCFAs 浓度更高，肌肉组织中 FAS 和 SCD1 基因表达显著增加，说明 IMF 脂肪酸组成与瘤胃微生物群落结构密切相关。此外，SUM 组与脂质代谢相关的 CPT2、PNALA2、FAS、PPARγ 和 SCD1 基因表达更高，UCP2 基因表达更低。基于此提出假设，微生物 - 瘤胃 - 肌肉轴通过 SCFAs 调控西藏羊 IMF 沉积，即 SCFAs 经循环系统到达肌肉组织，激活 PPARγ 基因表达，上调脂质合成相关基因，促进脂肪酸合成，增加肌肉脂肪含量。

结论

本研究发现夏季放牧的西藏羊肌肉脂肪酸含量更高，脂质代谢能力更强，提出微生物 - 瘤胃 - 肌肉轴调控西藏羊肌肉脂肪沉积的假设。不同肌肉脂肪酸含量的西藏羊瘤胃细菌群落组成和瘤胃上皮转录组表达谱存在差异，特定细菌产生的 SCFAs 在瘤胃上皮 SLC 基因调控下被吸收，经血液循环激活 PPARγ 基因，上调脂肪形成相关基因表达，促进脂肪酸合成，增加肌肉脂肪含量。该研究为高海拔地区放牧绵羊的脂肪沉积研究提供了新视角，为其生产管理提供了参考依据。