生物钟调控锌饥饿反应与次级代谢，对尖孢镰刀菌致病性至关重要

《SCIENCE ADVANCES》：Circadian clock is critical for fungal pathogenesis by regulating zinc starvation response and secondary metabolism

为探究生物钟在病原菌致病性中的作用，研究人员以尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）为对象开展研究。结果发现其生物钟通过调节锌饥饿反应和次级代谢影响致病性，该研究为防治植物真菌病害提供新方向。

　　在自然界中，从细菌到人类，许多生物体内都存在着一种神奇的 “内在时钟”—— 生物钟，它像一个精准的指挥官，调控着生物体内众多基因的节律性表达，帮助生物适应环境的昼夜变化。在真菌的世界里，生物钟同样发挥着重要作用，但在致病真菌方面，其具体功能和机制却迷雾重重。例如，虽然已知一些真菌的生物钟能调节某些生理过程，可对于大多数致病真菌而言，它们的生物钟是否真的具有功能，以及如何影响其致病性，科学家们还知之甚少。

尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是一种臭名昭著的植物病原菌，能引发多种植物疾病，严重威胁农业生产。为了揭开致病真菌生物钟的神秘面纱，探寻防治植物真菌病害的新策略，研究人员针对尖孢镰刀菌展开了深入研究。最终，他们的研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为这一领域带来了新的曙光。

研究人员运用了多种关键技术方法。在基因分析方面，通过 RNA 测序（RNA-seq）全面分析基因表达情况，结合 eJTK_CYCLE 算法筛选出节律性表达的基因；在蛋白研究层面，采用蛋白质免疫共沉淀（Co-IP）技术验证蛋白间的相互作用，利用染色质免疫沉淀 - 定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）确定蛋白与基因启动子的结合情况；此外，还通过构建突变体，观察其在致病性、生长及代谢等方面的变化，以此探究相关基因的功能。

研究结果如下：

1. 尖孢镰刀菌具有功能性生物钟：研究人员在尖孢镰刀菌中发现了多个生物钟相关基因，如 FoWC1、FoWC2 和 10 个 FoFRQ 蛋白（FRQ 同源物）。其中，FoFRQ1 与粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的 FRQ 序列相似度高达 81%，且在众多 FoFRQ 基因中表达量最高，是主要的 FRQ 蛋白。在持续黑暗（DD）条件下，Fofrq1的 mRNA 和蛋白水平呈节律性振荡，引入荧光素酶（LUC）报告基因后，野生型菌株的荧光素酶活性也表现出约 24 小时的昼夜节律，而 ΔFowc1突变体则失去了这种节律。同时，光照和温度变化能够影响Fofrq1的表达，表明尖孢镰刀菌的生物钟可以对环境信号做出响应。
2. 生物钟调控网络：研究人员构建了一系列生物钟基因敲除突变体，如 ΔFowc1、ΔFowc2、ΔFowcc、ΔFofrh、ΔFofrq1和 ΔFofrq10等。结果显示，这些突变体虽然菌丝生长未受影响，但色素产生发生改变。进一步研究发现，FoWC1 与 FoWC2 相互作用形成正调控复合物 FoWCC，激活Fofrq1的转录；FoFRQ1 与 FoFRH 相互作用形成负调控复合物，抑制 FoWCC 的活性，从而形成了一个完整的生物钟调控负反馈回路。
3. 生物钟控制尖孢镰刀菌的致病性：通过对番茄植株进行接种实验，研究人员发现，破坏生物钟核心振荡器的正调控因子（Fowc1和Fowc2）或负调控因子（Fofrq1和Fofrh），都会使尖孢镰刀菌失去致病性，而 ΔFofrq10突变体仍能诱导番茄植株出现枯萎症状，表明 FoFRQ1 在真菌致病性中起关键作用。此外，研究还发现尖孢镰刀菌的致病性存在昼夜变化，当菌株与植物的昼夜节律同步时，在黎明（Host-ZT0 和 Pathogen-ZT0）时感染症状最为严重；当菌株的昼夜节律与植物相反时，严重症状的高峰则转移到黄昏（Host-ZT12 和 Pathogen-ZT0）。
4. 生物钟基因表达：研究人员对尖孢镰刀菌进行了时间序列转录组分析，共鉴定出 993 个在 24 小时周期内节律性表达的基因。这些基因主要与转录因子和代谢成分相关，其中包括 9 个节律性转录因子，如 FoZafA 和 FoCzf1，它们在真菌致病性中发挥着重要作用。此外，研究还发现尖孢镰刀菌中存在一些与粗糙脉孢菌节律性基因和 WC - 2 靶基因同源的基因，表明真菌生物钟对基因表达的调控具有一定的保守性。
5. 生物钟调节锌饥饿反应：锌是真菌生长和致病所必需的金属元素，FoZafA 在调节锌稳态和介导真菌对锌饥饿的适应性反应中起关键作用。研究发现，在 ΔFowc2突变体中，FozafA的转录水平降低且节律性受损，ΔFozafA突变体的生长速率减慢，对番茄植株的致病性显著降低。此外，在锌饥饿条件下，生物钟突变体中FozafA和FozrfB（受 FoZafA 调控的高亲和力锌转运蛋白编码基因）的表达水平大幅下降，孢子产生也明显减少，表明生物钟在尖孢镰刀菌适应锌饥饿过程中起着至关重要的作用。
6. 生物钟控制的次级代谢产物有助于尖孢镰刀菌的致病性：真菌入侵植物往往依赖于次级代谢产生的植物毒素。研究人员发现，野生型菌株的次级代谢产物提取物能使番茄植株叶片在 48 小时内出现枯萎症状，而 ΔFowcc突变体的提取物则无此效果。进一步研究发现，转录因子 FoCzf1 能激活次级代谢产物镰刀菌酸（fusaric acid）的生物合成，且其表达具有节律性，受生物钟调控。在 ΔFoczf1和 ΔFowcc突变体中，镰刀菌酸的产量大幅下降，而互补菌株则能恢复其产量。此外，敲除Foczf1还会导致尖孢镰刀菌生长速率下降和致病性降低。

综合研究结论和讨论部分，该研究首次证实了尖孢镰刀菌中存在功能性生物钟，并且该生物钟通过调节锌饥饿反应和次级代谢，对真菌的致病性起着关键作用。这一发现揭示了病原菌与宿主相互作用的新机制，为开发基于生物钟调控的新型生物杀菌剂提供了理论依据，有望为农业生产中防治植物真菌病害开辟新的途径，对保障全球粮食安全具有重要意义。