miR-431-5p 靶向 KLK6 调控结直肠癌发生发展：潜在治疗新靶点的探索

《Hereditas》：A bioinformatics analysis of the target role of miRNA-431-5p on KLK6 in colorectal cancer

为解决结直肠癌（CRC）治疗难题，研究人员开展了 miRNA-431-5p 对 KLK6 在 CRC 中靶向作用的研究。通过生物信息学分析及细胞实验，发现 miR-431-5p 可靶向 KLK6，这为 CRC 治疗提供了潜在新途径，对临床治疗意义重大。

　　在全球范围内，结直肠癌（Colorectal Cancer，CRC）如同一个隐匿的杀手，严重威胁着人类的健康。据全球癌症统计数据显示，2020 年全球有 190 万新发病例，中国新发病例达 555477 人 ，死亡人数众多。尽管 CRC 的诊疗技术在不断进步，但晚期患者预后依旧不佳，死亡率较高，五年生存率较低。肿瘤标志物在肿瘤的早期诊断、预后评估和疗效评价中至关重要，因此，寻找新的治疗靶点并探究其机制成为攻克 CRC 的关键所在。

微小 RNA（MicroRNA，miRNA）作为一类长度在 21 - 25 个核苷酸之间的单链非编码 RNA，能通过与靶信使 RNA（mRNA）特异性结合，抑制翻译或促使其降解，进而调控基因表达。越来越多的证据表明，miRNA 参与多种癌症的发生、发展和预后过程，在肿瘤的研究中具有重要意义。然而，目前针对 CRC 中 miRNA 靶向调控的研究相对较少。在此背景下，重庆中医院肿瘤科的研究人员开展了一项旨在探究 miRNA - 431 - 5p 对 KLK6 在 CRC 中靶向作用的研究，该研究成果发表在《Hereditas》杂志上。

研究人员为了深入探究这一问题，运用了多种关键技术方法。首先，从 GEO 数据库获取 miRNA 数据集 GSE130084，从 TCGA 数据库下载相关样本数据。然后，利用 R 语言中的 edgeR 软件和 DESeq2 软件分别分析差异表达的 mRNA 和 miRNA。接着，借助 DAVID 数据库进行基因本体功能（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析。同时，运用加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co - expression Network Analysis，WGCNA）构建共表达网络，筛选关键基因。此外，还通过细胞实验，如 CCK - 8、Transwell、qPCR、WB、免疫组化和双荧光素酶报告基因实验等，在细胞水平进行验证。

研究结果如下：

1. 差异表达分析：基于 GSE130084 样本数据，筛选出 39 个与 CRC 相关的差异表达 miRNA，其中 19 个上调，20 个下调；从 TCGA 数据中收集到 3716 个显著差异表达的 mRNA，1839 个上调，1877 个下调。GO 富集分析显示，差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）主要富集在体液免疫反应、对细菌的防御反应等生物学过程（Biological Process，BP），细胞组成（Cellular Component，CC）方面主要集中在质膜外侧、免疫球蛋白复合物等，分子功能（Molecular Function，MF）方面主要涉及离子通道活性等。KEGG 富集表明，DEGs 主要富集在 cAMP 信号通路、神经活性配体 - 受体相互作用等途径。
2. WGCNA 分析：构建无标度网络，确定软阈值 β = 3（R2 = 0.8），识别出 11 个共表达模块。其中黑色、品红色、蓝色和绿松石色模块与肿瘤组织相关性较强，对黑色和品红色模块基因进行分析，发现其主要富集在角质化、细胞外基质 - 受体相互作用等方面。
3. 关键基因筛选及预后分析：通过蛋白质 - 蛋白质相互作用（Protein - protein Interaction，PPI）网络筛选出 10 个枢纽基因，包括 KRT16、KLK6 等。靶基因预测分析发现 miR - 431 - 5p 可靶向 KLK6。基于 GEPIA 数据库验证，KLK6 在肿瘤组织中表达显著升高，且高表达 KLK6 的患者预后较差，而 KRT6A 和 KRT6C 与患者总生存期（Overall Survival，OS）无明显相关性。
4. miR - 431 - 5p 对 KLK6 的调控作用：在 HCT116 细胞中转染 miR - 431 - 5p 抑制剂或模拟物，qPCR 和 WB 结果显示，miR - 431 - 5p 抑制剂促进 KLK6 表达，增强细胞活力、迁移和侵袭能力；miR - 431 - 5p 模拟物则抑制 KLK6 表达，降低细胞活力、迁移和侵袭能力。
5. miR - 431 - 5p 靶向 KLK6 的验证：双荧光素酶报告基因实验表明 miR - 431 - 5p 模拟物可抑制 KLK6 报告质粒的荧光素酶活性，细胞拯救实验进一步验证了 miR - 431 - 5p 通过靶向 KLK6 调节细胞活力、迁移和侵袭能力。

研究结论表明，通过生物信息学分析的靶基因预测发现 miR - 431 - 5p 可靶向枢纽基因 KLK6，细胞实验也证实了这一结果。这意味着 miR - 431 - 5p 能够抑制 KLK6 在 CRC 发展中的作用，利用小分子通过 miR - 431 - 5p 抑制 KLK6 为 CRC 治疗提供了一种有前景的方法。

在讨论部分，研究人员指出，CRC 具有高侵袭性，易发生早期转移，患者预后差。本研究筛选出的差异表达 miRNA 和 mRNA 以及富集的信号通路，为深入理解 CRC 的发病机制提供了线索。KLK6 作为 Kallikreins 家族成员，与肿瘤的发生、发展密切相关，其在 CRC 组织中高表达，与不良预后相关，但具体机制尚不清楚。而 miR - 431 - 5p 在多种癌症中发挥抗肿瘤作用，本研究首次发现其对 KLK6 的靶向作用，为 CRC 治疗提供了新的潜在靶点。不过，该研究仅在细胞水平进行，未来还需在动物模型和临床环境中进一步验证。

总体而言，这项研究揭示了结直肠癌相关基因及其分子机制，发现 miR - 431 - 5p 靶向 KLK6 并调节其表达，为 CRC 的临床诊断和治疗提供了潜在的生物标志物和靶向治疗策略，具有重要的理论和实践意义，为后续研究指明了方向。