利用独特外显子特异性 U1snRNA 变体挽救血友病 A 相关 5’ss 剪接突变的研究

《Molecular Medicine》：Rescue of a panel of Hemophilia A-causing 5’ss splicing mutations by unique Exon-specific U1snRNA variants

为解决异常 mRNA 剪接难以预测且影响被低估，以及针对血友病 A（HA）致病的 5’ss 突变治疗手段有限的问题，研究人员开展了对 9 个 F8 基因 5’ss 突变特征及挽救方法的研究。结果发现特定工程化 U1snRNA 可挽救突变，ExSpeU1s 效果更佳。这为 HA 治疗提供新方向。

　　在生命的微观世界里，基因表达的精准调控就像一场精密的交响乐演奏，而 mRNA 剪接则是其中至关重要的乐章。高等生物的基因表达高度依赖 mRNA 剪接，它能精确地界定外显子并去除内含子，从 pre - mRNA 中加工出成熟的 mRNA。几乎所有哺乳动物的 mRNA 都受可变剪接的调控，这一过程涉及庞大复杂的剪接体机器和众多顺式调控元件。然而，这种复杂性也使得 mRNA 剪接受不了丝毫差池，一旦出现异常，就可能成为许多人类疾病的 “导火索”。据统计，超过 10% 的致病突变发生在剪接位点，尤其是 5’剪接位点（5’ss），但目前人们对剪接在疾病中的重要性认识严重不足，许多外显子变异对剪接的影响难以预测。

在治疗领域，虽然已有针对某些疾病的剪接转换分子，如用于杜氏肌营养不良症临床试验的反义寡核苷酸，可诱导 DMD 基因外显子跳跃，以及用于脊髓性肌萎缩症临床实践中促进 SMN2 外显子 7 包含的药物，但针对血友病 A（Hemophilia A，HA）这种常见凝血因子障碍疾病，其致病的 5’ss 突变治疗手段仍十分有限。HA 是由凝血因子 VIII（FVIII）缺乏引起的，当 F8 基因的某些外显子因剪接突变发生跳跃时，就会导致 FVIII 合成异常。因此，探索有效的方法来纠正这些剪接突变，成为了医学研究的迫切需求。

为了攻克这一难题，意大利费拉拉大学生命科学与生物技术系的研究人员展开了深入研究。他们针对三个存在缺陷的 F8 外显子模型中的 9 个 5’ss 突变，利用工程化的 U1 小核 RNA（U1snRNA）进行研究，旨在明确这些突变的特征并寻找挽救方法。该研究成果发表在《Molecular Medicine》杂志上。

研究人员开展研究时，运用了多种关键技术方法。首先，借助 SpliceRover、MaxEntScan 和 RNAcofold 等工具进行计算分析，预测 3’和 5’ss 的强度。接着，构建重组质粒，将选定的人类 F8 基因组区域克隆到 pTB 质粒中，并通过定点突变引入 F8 变体。随后，在哺乳动物细胞（HEK293T 细胞）中进行表达和 mRNA 研究，转染相关质粒后提取 RNA，经逆转录和 PCR 扩增，用 ImageJ 软件分析正确和异常转录本的比例 。

在研究结果部分，研究人员发现所选的 9 个 5’ss 突变均会导致外显子跳跃。通过生物信息学分析预测，这些突变会使 5’ss 强度普遍下降，但不同算法的预测结果存在差异。实验评估发现，不同突变导致的外显子跳跃程度不同，且与患者中 FVIII 的残留水平大致相符，这进一步凸显了实验评估的重要性，因为生物信息学工具难以准确预测突变的致病性。

研究人员针对每个目标外显子设计了补偿性 U1snRNA（U1comp）和两个外显子特异性 U1snRNA（ExSpeU1snRNA，简称 ExSpeU1）。共转染实验结果显示，U1comp 能有效挽救所有外显子背景下的剪接模式，对某些突变的纠正效果显著。而 ExSpeU1s 的纠正效果具有外显子依赖性，在 exon 6 和 exon 22 中，ExSpeU1s 对几乎所有变体的剪接模式都有显著挽救作用，且在这两个外显子中，研究人员发现了比 U1comp 更有效的 ExSpeU1。

研究结论和讨论部分指出，该研究对位于三个 F8 外显子模型中的 5’ss 剪接变化进行了全面表征，明确了剪接缺陷与正确剪接转录本残留水平之间的关系，进而阐明了基因型与表型之间的联系。更为重要的是，研究人员首次发现对于同一 5’ss 内的所有变化，都存在一种独特的 ExSpeU1，其挽救效果优于 U1comp。这一发现为开发个性化 RNA 疗法开辟了新方向，有望用于治疗人类疾病中相对常见的外显子跳跃变体。不过，未来还需进一步优化这些基于 RNA 的疗法的设计和递送方式，并在相关疾病模型和临床环境中评估其疗效与安全性 。这项研究为血友病 A 的治疗带来了新希望，也为生命科学和医学领域在 RNA 治疗方面的发展提供了重要参考，激励着科研人员在攻克疑难病症的道路上不断前行。