解析人 ABCC4 识别 cAMP 的结构基础及配体识别灵活性研究：解锁细胞运输奥秘

《Cell & Bioscience》：Structural basis of human ABCC4 recognition of cAMP and ligand recognition flexibility

为解决 ABCC4 与 cAMP 结合的结构及配体识别机制不明，且常用 ATP 酶活性检测方法不适用于研究 cAMP 的问题，研究人员开展 ABCC4 与 cAMP 结合结构及 8-[Fluo]-cAMP 运输可行性研究，结果揭示了结合关键残基，发现结合灵活性，为相关研究提供参考。

　　在细胞的微观世界里，物质的运输就像一场精密的 “交通指挥”，而 ATP 结合盒（ABC）转运蛋白家族则是其中的关键 “指挥官”。ABCC4 作为 ABC 转运蛋白家族的一员，在细胞生理过程中扮演着重要角色，它能够运输多种底物，与多种疾病的发生发展密切相关。环磷腺苷（cAMP）被认为是 ABCC4 的运输底物之一，在癌症的发展进程中发挥着重要作用。然而，长期以来，人们对于 ABCC4 究竟如何识别和结合 cAMP，缺乏直接的结构层面的认知，并且 ABCC4 识别不同底物配体的机制也迷雾重重。此外，由于 cAMP 无法显著刺激 ABCC4 的 ATP 酶活性，常用的 ABC 蛋白 ATP 酶活性检测方法在研究 cAMP 时遭遇瓶颈，这使得 ABCC4 与 cAMP 的相关研究困难重重。

为了揭开这些谜团，哈尔滨工业大学生命科学与技术学院的研究人员勇挑重担，开展了一系列深入研究。他们成功解析了人 ABCC4 与 cAMP 复合物（hABCC4-cAMP）的冷冻电镜（cryo-EM）结构，这一成果如同在黑暗中点亮了一盏明灯，首次清晰地展示了 hABCC4 与 cAMP 的结合方式，并精准地确定了其中的关键氨基酸残基。

研究人员还将 hABCC4-cAMP 复合物的结构与另外两种 hABCC4 复合物（甲氨蝶呤（MTX）和前列腺素 E₂（PGE₂））的结构以及之前已发表的结构进行了细致入微的对比。通过这些对比，他们惊喜地发现了 hABCC4 在结合配体时的一些全新结构特征，进一步揭示了其在识别不同底物时的灵活性。

在此基础上，研究人员利用获得的结构信息，对 8-[Fluo]-cAMP 作为检测 hABCC4 转运 cAMP 的实验工具的可行性进行了大胆探索。他们的研究成果发表在《Cell & Bioscience》杂志上，为深入理解 ABCC4 的结构生物学以及开发新的 cAMP 检测方法提供了重要的理论依据和实践指导，对推动相关领域的研究具有深远意义。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是蛋白质表达与纯化技术，通过构建含有 hABCC4 基因的表达载体，利用昆虫细胞表达系统表达并纯化出高纯度的 hABCC4 蛋白。其次，采用冷冻电镜技术，对 hABCC4 与不同配体的复合物进行结构解析，获取高精度的蛋白结构信息。此外，还运用了 ATP 酶活性检测和细胞转运实验，来研究 hABCC4 的功能特性 。

下面让我们详细了解一下具体的研究结果：

1. hABCC4 的生化特性：研究人员对 hABCC4 蛋白的纯度和生理活性进行了严格检测。在没有底物存在的情况下，hABCC4 蛋白表现出基础 ATP 酶活性；而当加入关键转运底物 PGE₂后，其水解活性显著增强。这一结果充分证明了纯化后的 hABCC4 蛋白在体外洗涤剂环境中仍能保持良好的生理活性，为后续的结构研究提供了可靠保障。
2. hABCC4-cAMP 复合物的冷冻电镜结构：研究人员通过冷冻电镜技术，成功解析了 hABCC4-cAMP 复合物的结构。尽管该复合物结构的整体分辨率达到了 2.99 ?，但 cAMP 分子在底物结合口袋中的密度却不尽如人意。经过分析，研究人员推测这可能是由于 hABCC4 对 cAMP 的灵活识别和结合方式导致的。在结合过程中，cAMP 分子的部分区域与 hABCC4 紧密结合，而其他区域则相对松散，存在一定的流动性，从而使得电子密度无法完全覆盖整个分子。进一步研究发现，cAMP 主要与 hABCC4 中的 F324、L363、L367、F368 和 W995 等残基相互作用，其中 W995 残基起到了至关重要的作用。
3. hABCC4-MTX 和 hABCC4-PGE₂与先前报道结构的比较：研究人员获得了 hABCC4 与 MTX 和 PGE₂的复合物结构，并将其与先前报道的结构进行了对比。结果发现，PGE₂与 hABCC4 的结合具有高度特异性，灵活性较低；而 MTX 在与 hABCC4 结合时，表现出较高的局部灵活性。为了进一步验证 MTX 与 hABCC4 的结合灵活性，研究人员设计了细胞 MTX 转运实验，结果证实了 MTX 在 hABCC4 口袋中的结合确实存在灵活性。这一发现表明，hABCC4 在识别和结合不同底物时，具有不同程度的灵活性。
4. 荧光标记 cAMP 细胞转运实验的探索：为了探究 8-[Fluo]-cAMP 作为检测 cAMP 转运工具的可行性，研究人员进行了一系列实验。首先，他们通过实验发现，荧光标记部分对 8-[Fluo]-cAMP 的转运影响较小，hABCC4 能够识别 8-[Fluo]-cAMP 中的 cAMP 部分。接着，研究人员构建了一系列 hABCC4 突变体，通过细胞转运实验发现，突变体对 8-[Fluo]-cAMP 的转运能力发生了变化，这表明 hABCC4 可能以类似识别 cAMP 的方式结合 8-[Fluo]-cAMP。然而，要将 8-[Fluo]-cAMP 完全应用于研究 hABCC4 介导的 cAMP 转运，还需要进一步验证。

在讨论部分，研究人员深入探讨了 hABCC4 的底物结合灵活性。ABCC4 能够识别和运输多种底物，其底物结合口袋虽然结构相对固定，但在识别不同底物时可能采用了灵活的策略。从 hABCC4 与 MTX、PGE₂和 cAMP 的结合情况来看，不同底物的结合灵活性存在差异。这种灵活性可能与 ABCC4 的底物多样性以及刺激 ATP 酶活性的能力密切相关。同时，研究人员也指出，8-[Fluo]-cAMP 在应用于 cAMP 转运研究时仍面临一些挑战，如无法确定 hABCC4 是否直接运输 cAMP 以及 8-[Fluo]-cAMP 与 hABCC4 的直接运输关系还需进一步验证等。

总的来说，这项研究成功解析了 hABCC4-cAMP 复合物的结构，揭示了 hABCC4 识别 cAMP 的结构基础以及其在结合不同底物时的灵活性。同时，对 8-[Fluo]-cAMP 作为检测工具的可行性进行了探索，为后续研究提供了重要线索。虽然目前还存在一些未解决的问题，但该研究为深入理解 ABCC4 的功能和开发新的 cAMP 检测方法奠定了坚实基础，有望推动相关领域的进一步发展，为攻克与 ABCC4 相关的疾病提供新的思路和方向。