外泌体传递的 HSPA9：攻克多发性骨髓瘤硼替佐米耐药的新希望

《Cell Communication and Signaling》：Exosome-transmitted HSPA9 facilitates bortezomib resistance by targeting TRIP13/USP1 signaling in multiple myeloma

多发性骨髓瘤（MM）治疗中，硼替佐米（BTZ）耐药是一大难题。南京医科大学第一附属医院研究人员开展外泌体 HSPA9 在 MM 耐药机制的研究，发现外泌体 HSPA9 经 USP1/TRIP13 通路传递 BTZ 耐药，为克服 MM 治疗耐药提供新方向。研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》杂志上。

　　

在血液系统疾病的治疗领域，多发性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）如同一块难啃的 “硬骨头”，严重威胁着人们的健康。它作为第二常见的血液系统恶性肿瘤，是一种骨髓肿瘤性疾病，特征为恶性浆细胞不受控制地增殖。近年来，虽然在 MM 发病机制的研究上取得了不少进展，但由于肿瘤异质性和克隆进化导致的耐药问题，MM 仍然是一种极具破坏性的疾病。

硼替佐米（Bortezomib，BTZ）作为 MM 治疗的一线选择性蛋白酶体抑制剂（Proteasome Inhibitor，PI），本应是对抗 MM 的 “有力武器”，然而 BTZ 耐药却成为了 MM 治疗道路上的 “拦路虎”，严重阻碍了治疗效果。因此，深入探究 BTZ 耐药的机制，寻找新的治疗靶点迫在眉睫。

在此背景下，南京医科大学第一附属医院的研究人员勇挑重担，开展了一项意义重大的研究。他们将目光聚焦在外泌体热休克 70kDa 蛋白 9（Heat Shock 70kDa Protein 9，HSPA9）上，致力于分析 BTZ 耐药的 MM 细胞分泌的外泌体 HSPA9，是如何将耐药性传递给 BTZ 敏感的 MM 细胞的。经过一系列深入研究，他们发现了一个全新的分子调控网络：MM 细胞来源的外泌体 HSPA9 能够通过 USP1/TRIP13 信号通路传递 BTZ 耐药性。这一发现为攻克 MM 的 BTZ 耐药问题带来了新的希望，也为 MM 的临床治疗开辟了新的方向。该研究成果发表在《Cell Communication and Signaling》杂志上。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们从患者血清中提取外泌体，利用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）和透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）鉴定外泌体的大小和形态。通过液相色谱 - 质谱联用技术（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，LC-MS/MS）和公共数据库筛选外泌体 HSPA9。还借助细胞计数试剂盒 - 8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）、蛋白质免疫印迹法（Western Blotting，WB）、集落形成实验等在体外研究 HSPA9 的作用；运用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）、免疫荧光（Immunofluorescence，IF）等实验确定 HSPA9-USP1-TRIP13 复合物的调控网络；构建异种移植小鼠模型，并进行体内光学成像，在体内探究外泌体 HSPA9 的作用。此外，研究人员还纳入了南京医科大学第一附属医院 2017 年 12 月至 2018 年 8 月收治的 MM 患者作为样本队列进行研究。

下面详细介绍一下该研究的主要结果：

1. 血清外泌体的提取与鉴定：研究人员从健康供体（Healthy Donor，HD）、BTZ 敏感和 BTZ 耐药的 MM 患者血清中提取外泌体。NTA 测量显示外泌体大小在 10 - 100nm 之间，TEM 观察到其呈杯状球形，证实提取的囊泡为外泌体。

2. 外泌体 HSPA9 与 MM 对 BTZ 耐药的关系：对血清外泌体进行蛋白质质谱分析，发现与 BTZ 敏感组相比，BTZ 耐药组中 HSPA9 显著上调。WB 分析、数据库数据分析以及骨髓活检组织的免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）分析等进一步证实，外泌体 HSPA9 和 HSPA9 蛋白与 MM 对 BTZ 的耐药相关，且 HSPA9 高表达会恶化 MM 疾病进展。

3. HSPA9 蛋白对 MM 细胞生物学行为的影响：在体外实验中，敲低 HSPA9 显著抑制 MM 细胞增殖，增强其对 BTZ 的敏感性，促进细胞凋亡；而过表达 HSPA9 则促进 MM 细胞增殖，增强 BTZ 耐药性，并维持干细胞特性。

4. 外泌体 HSPA9 传递耐药特性：实验表明，BTZ 敏感的 MM 细胞可通过内化 BTZ 耐药细胞释放的外泌体 HSPA9 获得耐药性，该过程在 mRNA 和蛋白质水平均受到调控。

5. HSPA9 与 TRIP13 的调控关系：通过免疫沉淀结合质谱（Immunoprecipitation Binding Mass Spectrometry，IP-MS）筛选出与 HSPA9 相互作用的蛋白 TRIP13，Co-IP 实验证实二者相互作用。HSPA9 正向调节 TRIP13，且 TRIP13 在 BTZ 耐药患者的骨髓活检组织和复发 MM 患者中高表达。

6. HSPA9 对 TRIP13 蛋白稳定性的调节机制：研究发现 HSPA9 招募去泛素化酶 USP1，抑制 TRIP13 的泛素化降解，维持其蛋白稳定性。HSPA9 通过其 C 末端招募 USP1，N 末端 ATP 酶结构域促进泛素化。抑制 HSPA9-USP1-TRIP13 复合物的表达可克服体外 BTZ 耐药。

7. 外泌体 HSPA9 在体内的作用：在异种移植小鼠模型中，注射 PKH26 标记的外泌体 HSPA9 后，发现其在小鼠体内分布广泛且代谢较慢。给予 BTZ 或 ML323（USP1 抑制剂）治疗，添加外泌体 HSPA9 可逆转肿瘤生长抑制。IHC 染色显示，添加外泌体 HSPA9 的小鼠肿瘤中 HSPA9 和 Ki-67 表达更高，表明外泌体 HSPA9 在体内可促进 MM 增殖和 BTZ 耐药。

综合研究结果和讨论部分来看，该研究首次揭示了外泌体 HSPA9 在 MM 对 BTZ 耐药中的关键作用及分子机制，为理解 MM 耐药机制提供了新视角。这一发现有助于开发针对 HSPA9 的小分子药物，为克服 MM 的 BTZ 耐药提供了潜在的治疗靶点，有望改善 MM 患者的临床治疗效果，在 MM 的治疗领域具有重要的理论和实践意义。