通过改造长尾纤维拓宽 T5 样沙门氏菌噬菌体宿主范围及其在牛奶中的应用研究

《BMC Microbiology》：The change of long tail fibers expanded the host range of a T5-like Salmonella phage and its application in milk

沙门氏菌是牛奶中常见的食源性病原体，随着耐药性问题加剧，急需新的治疗方法。研究人员以 T5 样噬菌体为对象，开展宿主范围扩展的研究。结果显示，重组噬菌体RPA1?3?和RPB1?3?宿主范围扩大，在牛奶中能抑制沙门氏菌生长，为噬菌体生物防治应用提供参考。

　　在牛奶的世界里，微生物污染就像隐藏在暗处的 “幽灵”，时刻威胁着牛奶的质量与安全，而沙门氏菌便是其中臭名昭著的一员。它作为常见的食源性病原体，拥有超过 2600 种血清型，能引发肠胃炎，尤其对老人、婴儿和免疫功能低下人群危害极大。随着抗菌药物的大量使用，沙门氏菌的耐药性和多重耐药性问题日益严重，传统治疗手段的效果大打折扣。在此背景下，寻找新的替代疗法迫在眉睫，噬菌体因其独特优势进入了研究人员的视野。然而，噬菌体的宿主特异性限制了其应用，如何拓宽噬菌体的宿主范围成为关键问题。

为了解决这一难题，南京农业大学、新疆农业大学等多单位的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们聚焦于 T5 样噬菌体，通过改造其长尾纤维基因，期望实现宿主范围的扩展，并探究这些改造后的噬菌体在牛奶中抑制沙门氏菌的效果。最终，研究成果发表在《BMC Microbiology》杂志上。

研究人员在此次研究中运用了多种关键技术方法。首先是基因组测序（Genome sequencing），对噬菌体 PH204、RPA1?3?和RPB1?3?进行全基因组测序，深入了解其基因特征。其次是构建重组质粒和重组噬菌体，通过同源重组技术，将噬菌体 SP76 的部分基因片段导入 PH204 中，获得重组噬菌体。此外，还采用了一系列实验方法来评估噬菌体的各项特性，如通过宿主范围分析（Host range analysis）确定噬菌体的裂解菌株范围，利用一步生长曲线（One-step growth curve）测定噬菌体的潜伏期和裂解量等。

下面来看看具体的研究结果：

• 噬菌体的形态与基因组特征：透射电子显微镜（TEM）图像显示，噬菌体 PH204 和 SP76 都具有多面体头部和长而不可收缩的尾部，属于 Demerecviridae 家族。基因组测序结果表明，PH204 基因组大小为 110,316 bp，SP76 为 111,639 bp，平均 GC 含量分别为 39% 和 39.9%。系统发育分析显示，它们分别属于 Tequintavirus 和 Epseptimavirus 属。
• 长尾纤维的比较与重组噬菌体的构建：对比 PH204 和 SP76 的 PB3 和 PB4 序列，发现二者与另一种噬菌体 vB_SenE22 有较高同源性，但也存在差异，这些差异可能与宿主范围不同有关。研究人员利用同源重组技术，将 SP76 的 Peg162 和 Peg163 基因片段替换 PH204 的 Peg158 和 Peg159 基因片段，成功构建并分离出重组噬菌体RPA1?3?和RPB1?3?。
• 宿主范围分析：研究人员使用 97 株沙门氏菌对噬菌体进行宿主范围测试。结果显示，PH204 能裂解 30 株，SP76 能裂解 64 株，而重组噬菌体RPA1?3?和RPB1?3?的宿主范围明显拓宽，都能裂解 54 株沙门氏菌。
• 生物学特性分析：在感染复数（MOI）方面，SP76 的最佳 MOI 为 0.0001，PH204 和RPA1?3?为 0.1，RPB1?3?为 0.001。热稳定性和 pH 稳定性测试表明，RPA1?3?和RPB1?3?与亲本噬菌体 PH204 和 SP76 相似，在一定温度和 pH 范围内保持稳定。一步生长曲线显示，RPA1?3?、PH204、RPB1?3?和 SP76 的潜伏期约为 30 分钟，裂解时间和裂解量各有不同，但RPA1?3?和RPB1?3?的生长周期与 PH204 相近。噬菌体吸附实验表明，RPA1?3?和RPB1?3?的吸附率低于亲本噬菌体。
• 重组噬菌体的稳定性和抑菌能力：对重组噬菌体RPA1?3?和RPB1?3?进行传代稳定性测试，发现其 Peg162 和 Peg163 基因在 1 代、10 代和 20 代均未发生突变，遗传稳定性良好。在浮游状态下，重组噬菌体RPA1?3?、RPB1?3?和 PH204 能有效抑制沙门氏菌 ZWSA605 的生长，且较高剂量的噬菌体抑制效果更明显，但对沙门氏菌 ZWSA337 的抑制能力较弱。
• 噬菌体在牛奶中的应用效果：在牛奶生物防治实验中，噬菌体 PH204 和 SP76 分别对 ZWSA605 和 ZWSA337 有显著抑制作用。RPA1?3?和RPB1?3?在 20℃时能有效抑制 ZWSA605 生长，但对 ZWSA337 无抑制作用。且 20℃时噬菌体处理组的活菌数明显低于 4℃处理组。

研究结论和讨论部分指出，通过修饰高度同源的 T5 噬菌体 SP76 和 PH204 的 PB3 和 PB4 区域，成功拓宽了噬菌体的宿主范围。这表明 PB3 和 PB4 可能是某些 T5 样噬菌体宿主范围的决定因素，且 PB4 对 T5 噬菌体 Tequintavirus 属的吸附功能部分必要。虽然工程噬菌体RPA1?3?和RPB1?3?对牛奶中沙门氏菌 ZWSA605 的抑菌效果低于亲本噬菌体 PH204，但仍具有一定的控制作用。该研究为探索 PB3 和 PB4 在 Tequintavirus 及其他 T5 样噬菌体中的功能提供了参考，也为修饰噬菌体以改变或扩大其宿主范围提供了重要依据，有助于推动噬菌体在食品生物防治领域的应用和发展。